分光光度法檢測特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉中左旋肉堿

張海紅，田洪蕓，王文特，任雪梅，王駿

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101;2.山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟南 250101)

0 引 言

左旋肉堿（L-carnitine）又稱肉毒堿或維生素BT，是人類必須的一種營養(yǎng)物質(zhì)，其主要功能是轉(zhuǎn)運脂肪進入線粒體，促進脂肪酸氧化，為機體提供能量[1-2]。人體的左旋肉堿來源：一是通過肝臟和腎臟進行內(nèi)源性合成，二是從膳食攝?。ㄖ饕莿游镄允称罚3]。人體左旋肉堿缺乏將影響脂肪酸的代謝，從而導(dǎo)致能量合成不足，出現(xiàn)易疲勞、肌肉無力、心慌等癥狀，嚴重者會出現(xiàn)代謝紊亂，昏迷甚至死亡。隨著人們對左旋肉堿營養(yǎng)價值的關(guān)注及認可，它已經(jīng)被越來越多地用于減肥食品、嬰幼兒食品、飲料、營養(yǎng)補充劑、臨床等方面[4]。嬰幼兒機體尚未發(fā)育成熟，自身不能合成左旋肉堿或合成量不能滿足機體需要，所以準確定量嬰幼兒配方食品中的左旋肉堿含量，對保障嬰幼兒營養(yǎng)攝入是至關(guān)重要的[5]。GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》、GB 10767-2010《食品安全國家標準較大嬰兒和幼兒配方食品》、GB 29922-2013《食品安全國家標準特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》和GB 25596-2010《食品安全國家標準特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》均將左旋肉堿列為可選擇性添加的營養(yǎng)成分，并規(guī)定了最小添加量。

目前左旋肉堿的檢測主要采用分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、化學(xué)法、毛細管電泳色譜法和免疫法等[6-11]。我國現(xiàn)行相關(guān)檢測方法標準為GB 29989-2013《嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》[12]，屬于分光光度法，適用范圍為嬰幼兒食品和乳品。在日常檢驗工作中發(fā)現(xiàn)，對于氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品，同時配料中添加了麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉的產(chǎn)品，存在以下缺點：(1)高氯酸沉淀蛋白后樣品溶液難以過濾，過濾時間比較長，影響了實驗效率和批量化要求;(2)過濾下來的濾液不澄清，吸光度值通常大于1，不滿足分光光度比色的溶液要求，嚴重影響紫外吸收的測定，數(shù)據(jù)離散性大，加標回收率不好。原因有：一是氨基酸和小分子量多肽是小分子，高氯酸沉淀劑不能將其沉淀下來，普通濾紙不能過濾掉，甚至?xí)氯麨V紙孔，導(dǎo)致過濾速度慢和濾液渾濁；二是樣品配料添加的麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉的冷水溶脹，黏度增大，也會使樣品處理液難以過濾[1-14]。

本研究在GB 29989-2013標準的基礎(chǔ)上，利用Taka淀粉酶來水解樣品中麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉，對前處理方法加以改進，克服以上缺點，建立了氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中左旋肉堿的檢測方法，并對圣元優(yōu)博、青島瀚姆、貝因美、雅培、雀巢、紐迪希亞等6家以上企業(yè)的氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品或試制品進行了測定，擬為這類特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的質(zhì)量安全監(jiān)管和質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計Evolution 300，美國賽默飛世爾公司；恒溫水浴鍋DZKW-S-6，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

純度≥98%左旋肉堿對照品，美國Sigma公司；分析純高氯酸，天津市鑫源化工有限公司；分析純氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)、TaKa淀粉酶，均為美國Sigma公司；乙酰輔酶A，羅氏公司。

嬰兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和乳蛋白部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品均為日常工作中的檢驗樣品，涉及6家以上國內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

左旋肉堿標準儲備液（80μg/mL）：精確稱取20 mg于102±2℃烘箱中烘2 h的左旋肉堿（純度≥98%），用水定容至250 mL容量瓶中。此溶液可在4℃冰箱中保存1個月。

左旋肉堿標準工作液：分別吸取左旋肉堿標準儲備液0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，該標準系列濃度分別為1.6、3.2、6.4、9.6、16μg/mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

高氯酸溶液（13%）：移取13 mL高氯酸用水稀釋至100 mL。

氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：稱取40 g氫氧化鈉用水溶解，冷卻后稀釋至100 mL。

氫氧化鉀溶液（4.0 mol/L）：稱取22.4 g氫氧化鉀用水溶解，冷卻后稀釋至100 mL。

顯色儲備液：分別稱取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 g N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、0.185 g乙二胺四乙酸二鈉溶于30 mL水中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)p H至7.4～7.6，用水定容至50 mL。顯色儲備液可在4℃冰箱中保存3個月。

顯色工作液：吸取5.00 mL顯色儲備液用水定容至25 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰輔酶A（Acetyl CoA）溶液：稱取20.0 mg乙酰輔酶A溶于2.0 mL水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)溶液：吸取100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，加入2 mL水溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

TaKa淀粉酶溶液：稱取2.50 g TaKa淀粉酶溶于50 mL水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

（1）試樣提取。稱取試樣5 g（精確至0.0001 g）于50 mL燒杯中，用30 mL 40℃溫水溶解并轉(zhuǎn)入100 mLl容量瓶中，準確加入TaKa淀粉酶溶液1 mL，混勻，于60℃水浴水解30 min，再加入10 mL 13%高氯酸溶液，混合均勻后靜置20 min，用水定容至刻度，混勻，用定量快速濾紙過濾。

（2）測定液的制備。移取濾液20 mL，置于50 mL廣口錐形瓶中，用4 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)整濾液p H至12.5～13.0，置于40℃水浴60 min。取出冷卻后用高氯酸溶液調(diào)整pH至7.0～7.5。將溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用水定容，混勻，于4℃冰箱中放置過夜。

將試樣處理液從冰箱中取出，放置至室溫，用一次性注射器吸取上清液，用0.45μm濾膜過濾于5 mL PE離心管中備用。

1.2.3 測定

分別吸取左旋肉堿標準工作液、濾膜過濾后的試樣測定液2.0 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL顯色工作液、100μL乙酰輔酶A溶液，蓋上比色皿蓋，混合均勻，放置5 min后立即放入已用水調(diào)零的紫外可見分光光度計中，在波長為412 nm下測定吸光值A(chǔ)1并迅速加入100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，迅速混合均勻，放置10 min立即后于紫外可見分光光度計中測定吸光值A(chǔ)2。以左旋肉堿標準工作液的濃度為橫坐標，以標準工作液的吸光值A(chǔ)2與吸光值A(chǔ)1之差為縱坐標，制作標準曲線。用試樣測定液的吸光值A(chǔ)2與吸光值A(chǔ)1之差在標準曲線上查得試樣測定液中左旋肉堿的濃度，進而計算樣品中左旋肉堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

選取一種氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，該樣品配料中添加了麥芽糊精(在配料表中第一位)和預(yù)糊化淀粉，按照國標方法，樣品處理液難以過濾，濾液不澄清。

2.1.1 加酶量

稱樣5.0 g，加一定量的酶(如1%，就是5 g樣品，加0.05 g酶)，水浴溫度60℃，水浴時間30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過濾，考察加酶量為0%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%時樣品過濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見圖1所示。

圖1 樣品溶液的透光率隨加酶量的變化

由圖1可以看出，隨加酶量的增加，樣品溶液的透光率顯著增大，并于加酶量0.5%之后趨于穩(wěn)定并稍有下降，因此確定1%為最佳加酶量。

2.1.2 水解時間

稱樣5.0 g，加酶量1%，水浴溫度60℃，水解一定時間。水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過濾，考察水解時間為5、10、20、30、40、50、60 min時樣品過濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見圖2所示。

圖2 樣品溶液的透光率隨水解時間的變化

由圖2可以看出，隨水解時間的延長，樣品溶液的透光率逐漸增大，并于10 min之后趨于穩(wěn)定。鑒于特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，適當延長樣品的水解時間，確定最佳水解時間為30 min。

2.1.3 水解溫度

稱樣5.0 g，加酶量1%，一定溫度下水解30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過濾，測定樣品過濾液透光率。通常淀粉酶的使用溫度為45～70℃[15]，考察了水浴溫度40、50、60、70℃時樣品過濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見圖3所示。

由圖3可以看出，樣品溶液的透光率先逐漸增大，后稍有下降，并且50℃以上時，樣品溶液的透光率都大于90%，因此確定最佳水解溫度為60℃。

2.1.4 沉淀劑用量

圖3 樣品溶液的透光率隨水浴溫度的變化

Taka淀粉酶水解了麥芽糊精等淀粉類物質(zhì)，同時為了避免Taka淀粉酶對后面的左旋肉堿酶反應(yīng)有影響和消除蛋白質(zhì)及其多肽鏈影響[16]，需要進一步把樣品溶液中的Taka淀粉酶和樣品蛋白質(zhì)沉淀下來。稱樣5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加一定體積的13%高氯酸溶液，靜置20 min，定容至100 mL，搖勻，過濾，考察了0、2.5、5.0、7.5、10.0mL高氯酸溶液加入量的對樣品過濾溶液透光率的影響。具體數(shù)據(jù)見圖4所示。

圖4 樣品溶液的透光率隨高氯酸溶液加入量的變化

由圖4可以看出，隨著高氯酸溶液加入量的增大，樣品過濾液的透光率逐漸增大并在5 mL之后趨于穩(wěn)定。因此10 mL 13%高氯酸溶液加入量是足夠的，與國標方法一致。

因此，確定了最佳前處理條件，稱樣5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加10 mL 13%高氯酸溶液，混勻，靜置20 min，定容至100 mL，混勻，過濾。

2.2 線性曲線及檢出限

在波長412 nm處樣品測定液反應(yīng)前后吸光度值，并繪制標準曲線(見圖5)，2 mL測定液中左旋肉堿濃度在0～16μg/mL范圍內(nèi)(相當于5 g樣品中左旋肉堿含量0～80 mg/100g)呈良好的一次線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.9998，樣品檢測限(LOD)為2mg/100g，與國標方法一致。

2.3 精密度實驗

選取嬰兒配方乳粉R和氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，進行精密度實驗，并與國標方法對比。具體數(shù)據(jù)見表1。

可見，對于嬰幼兒配方乳粉R，未酶解樣品的左旋肉堿平均值為19.0 mg/100g，相對標準偏差RSD為2.78%；酶解樣品的左旋肉堿平均值為18.9 mg/100g，相對標準偏差RSD為1.69%。兩種前處理結(jié)果一致，數(shù)據(jù)分布集中，精密度好，相對標準偏差都符合實驗質(zhì)量控制要求[17]。

圖5 左旋肉堿標準曲線

對于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，未酶解樣品的左旋肉堿平均值為53.1 mg/100g，相對標準偏差RSD為9.56%，數(shù)據(jù)離散程度大；酶解樣品的左旋肉堿平均值為60.5 mg/100g，相對標準偏差RSD為2.40%。說明，對于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品A，只有酶水解樣品精密度好，符合實驗質(zhì)量控制要求。

2.4 加標回收率實驗

選取氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，在5 mg/100g、15 mg/100g和50 mg/100g 3個添加水平下進行加標回收實驗，并與國標方法進行對比。具體數(shù)據(jù)見表2。

對于嬰幼兒配方乳粉R，在3個添加水平下，未酶解樣品的加標回收率為98.0%～103.0%，相對標準偏差RSD為0.89%～3.30%;酶解樣品的加標回收率為100.3%～104.5%，相對標準偏差RSD為0.82%～2.48%。說明，對于嬰幼兒配方乳粉，未酶解和酶水解樣品的加標回收率和相對標準偏差都符合實驗質(zhì)量控制要求。

對于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，在3個添加水平下，未酶解樣品的加標回收率為81.7%～109.6%，相對標準偏差RSD為10.3%～12.7%，在5 mg/100g低加標水平下，加標回收率偏低，同時3個水平的數(shù)據(jù)相對標準偏差均大于4，數(shù)據(jù)離散程度大，不符合實驗質(zhì)量控制要求;酶解樣品的加標回收率為96.1%～108.5%，相對標準偏差RSD為3.18%～3.85%，加標回收率比較好，實驗數(shù)據(jù)精密度高。說明，對于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，只有酶水解樣品的加標回收率和相對標準偏差符合實驗質(zhì)量控制要求。

2.5 實際樣品測定

目前市場上氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉配料表中碳水化合物來源主要是以下幾種：麥芽糊精、預(yù)糊化淀粉、玉米糖漿、葡萄糖漿、白砂糖、乳糖和淀粉糖，其中添加最多的是麥芽糊精和葡萄糖漿。采用酶水解前處理方法，考察了多種品牌的氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉或試制品左旋肉堿的檢測情況。

2.5.1 不同基質(zhì)樣品的精密度實驗

考察了8種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，其中YA和YP樣品添加了乳糖、麥芽糊精和白砂糖，YPYB樣品添加了乳糖、固體玉米糖漿和麥芽糊精，YPYM樣品添加了固體玉米糖漿、預(yù)糊化淀粉和麥芽糊精，TT樣品只添加了葡萄糖漿，SMY和SLL添加了麥芽糊精和葡萄糖漿，AA樣品添加了麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉，檢測結(jié)果見表3。

未酶解樣品，除了TT樣品，其他樣品過濾速度較慢，檢測結(jié)果相對標準偏差RSD為3.04%～12.6%，數(shù)據(jù)離散程度大，精密度不好。對于酶解樣品，酶水解和沉淀蛋白后，均易于過濾，濾液澄清，檢測結(jié)果相對標準偏差RSD為2.62%～3.75%，精密度比較好。

表1 2種前處理方法的左旋肉堿檢測結(jié)果

表2 加標回收率和相對標準偏差（n=6）

表3 2種前處理方法的左旋肉堿檢測結(jié)果

表4 加標回收率和相對標準偏差（n=6） %

2.5.2 不同基質(zhì)樣品的加標回收率實驗

選取3種樣品，進行酶水解前處理，在15 mg/100g添加水平進行加標回收實驗，樣品加標回收率結(jié)果見表4。

3種酶解樣品的加標回收率為102.7%～108.8%，相對標準偏差RSD為1.76%～3.85%，加標回收率比較好，實驗數(shù)據(jù)精密度高。說明對于不同基質(zhì)的氨基酸和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中左旋肉堿的檢測，本方法具有比較好的準確性和精密度。

3 結(jié) 論

采用Taka淀粉酶水解樣品的前處理方法簡單、易于操作、干擾因素少。對于氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉，該方法的精密度高，加標回收率好。同時解決了氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉過濾難和濾液不澄清的問題，縮短了前處理時間，提高了檢測效率，靈敏度高，重復(fù)性好，滿足了氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中左旋肉堿批量化檢測需求[18-19]。