萊菔硫烷對人黑色素瘤A375細(xì)胞自噬的影響

張心 王博涵 孫健

黑色素瘤（melanoma）是一種惡性程度極高的腫瘤，手術(shù)聯(lián)合化療是其主要治療手段，但因病情進(jìn)展快，治療效果并不理想［1］。因此，亟需探索更高效的治療方法。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是十字花科蔬菜中存在的一種化學(xué)活性成分，具有調(diào)控化學(xué)致癌物代謝酶活性、抗炎、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用［2］。在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤等研究中還發(fā)現(xiàn)SFN可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且聯(lián)合自噬抑制劑可進(jìn)一步增強促凋亡作用［3-6］。但目前SFN及聯(lián)合用藥對黑色素瘤的作用仍不清楚。本研究探討SFN在人黑色素瘤A375細(xì)胞自噬中的作用，以期為黑色素瘤臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人黑色素瘤A375細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；SFN（純度≥95%）、自噬抑制劑氯喹（CQ）購自Sigma Aldrich公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶購自 Solarbio 公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑購自武漢博士德公司；二甲基亞砜（DMSO）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料均購自TaKaRa公司；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（LC3）、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin單克隆抗體和相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A375細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 U青霉素和100 U鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長完全貼壁后，用0.25%胰酶消化后傳代，取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞按2×105·mL-1密度接種于 96孔板，每孔 200 μL，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%融合時，分別加入不同濃度的 SFN （0 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1），同時以相同體積的含0.1% DMSO的培養(yǎng)基為空白對照組；同等條件下將自噬抑制劑 CQ 10 μL（20 μmol·L-1）加入 A375 細(xì)胞培養(yǎng)2 h，然后加入以上不同濃度的SFN。培養(yǎng)24 h后，每孔加入 MTT 試劑 20 μL（5 μg·mL-1），4 h 后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，室溫避光震蕩10 min。于酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖率（%）=［（對照組OD值-實驗組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%。實驗重復(fù)3次。

1.4 Real-time PCR法檢測自噬和凋亡分子mRNA的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA，測定濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并采用SYBR染料法進(jìn)行PCR定量。PCR反應(yīng)體系：2×UltraSYBR Mixture（With ROXⅠ）10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 0.8 μL，RNase-Free H2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)。各引物序列中，β-actin上游為5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′，下游為 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′；LC3 Ⅱ 上 游 為 5′-CCACACCCAAAGTCCTCACT-3′，下游為 5′-CACTGCTGCTTTCCGTAACA-3′；LC3Ⅰ上游為 5′-GTCACCGGGCGAGTTACC-3′，下游為 5′-CTCGCGCTCAAGGGCTC-3′；Beclin-1 上游為 5′-AGCTGCCGTTATACTGTTCT-3′，下游為 5′-TGTGTCTTCAATCTTGCCTT-3′；p62 上游為5′-AAATGGGTCCACCAGGAAACTGGA-3′，下游為 5′-TCAACTTCAATGCCCAGAGGGCTA-3′；Bcl-2 上游為5′-CTGGTGGACAACATCGC-3′，下游為 5′-GGAGAAATCAAACAGAGGC-3′；Bax 上游為 5′-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3′，下游為 5′-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3′；Caspase-3 上游為 5′-CTGGACTGTGGCATTGAGAC-3′，下游為 5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′。以 β-actin 為內(nèi)參。采用 2-△△Ct法計算LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，并按照BCA試劑盒的操作步驟檢測蛋白濃度。用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入 LC3、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin 一抗（稀釋比例分別為 1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000 和 1∶5 000），4 ℃孵育過夜，用 TBST 洗膜 3 次后加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶10 000）孵育，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測，Image J軟件分析灰度值，以β-actin作為內(nèi)參校正蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步多重比較采用Dunnett's t檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN可抑制A375細(xì)胞增殖

MTT法檢測結(jié)果顯示，SFN呈劑量依賴式抑制A375細(xì)胞增殖，各組間的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=21.517，P＜0.001），且與對照組（0 μmol·L-1SFN）比較，不同濃度（5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1 和 40 μmol·L-1）SFN 組的細(xì)胞增殖率均降低（P＜0.05），見圖 1。

圖1 不同濃度SFN對A375細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of SFN on the proliferation of A375 cells

2.2 SFN調(diào)控A375細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)分子LC3、Beclin-1和p62的表達(dá)

Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，不同濃度SFN處理A375細(xì)胞后，各組細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)分子LC3Ⅱ、Beclin-1和 p62 mRNA 表達(dá)（FLC3Ⅱ=17.561，PLC3Ⅱ＜0.001；FBeclin-1=18.622，PBeclin-1＜0.001；Fp62=7.843 ，Pp62=0.004）和蛋白表達(dá)水平（FLC3Ⅱ/LC3Ⅰ=10.080，PLC3Ⅱ/LC3Ⅰ=0.002；FBeclin-1=40.132，PBeclin-1＜0.001；Fp62=9.061，Pp62=0.002）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而LC3ⅠmRNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（FLC3Ⅰ=0.448，PLC3Ⅰ=0.772）。與對照組比較，不同濃度SFN均能上調(diào)A375細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)，且隨著SFN干預(yù)劑量的增加而明顯升高（P＜0.05）；但A375細(xì)胞內(nèi)p62 mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，且隨著SFN干預(yù)劑量的增加而逐漸下降（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度SFN處理A375細(xì)胞后LC3、Beclin-1和p62的表達(dá)情況Fig.2 Expression of LC3、Beclin-1 and p62 in A375 cells after treated with different concentrations of SFN

2.3 SFN調(diào)控A375細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)

Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，不同濃度SFN處理A375細(xì)胞后，各組細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)（FBcl-2=68.049，PBcl-2＜0.001；FBax=96.653，PBax＜0.001；FCaspase-3=49.272，PCaspase-3＜0.001）和蛋白表達(dá)水平（FBcl-2=82.943，PBcl-2＜0.001；FBax=151.221，PBax＜0.001；FCaspase-3=59.764，PCaspase-3＜0.001）差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，不同濃度SFN均可下調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，且隨SFN干預(yù)劑量的增加逐漸下降（P＜0.05）；而Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，且隨SFN干預(yù)劑量增加而逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 不同濃度SFN處理A375細(xì)胞后Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)情況Fig.3 Expression of Bcl-2、Bax and Caspase-3 in A375 cells after treated with different concentrations of SFN

2.4 自噬抑制劑CQ聯(lián)合SFN對A375細(xì)胞增殖的影響

不同濃度聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.924，P＜0.001），進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，不同濃度SFN組細(xì)胞增殖率較空白組低，且呈劑量依賴方式（P＜0.05）；但CQ組細(xì)胞增殖率與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.862），SFN+CQ組細(xì)胞增殖率較相應(yīng)濃度的單獨SFN組均下降（P＜0.05），見圖4。

圖4 SFN聯(lián)合自噬抑制劑CQ對A375細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of SFN combined with CQ on the proliferation of A375 cells

3 討論

SFN是十字花科植物中存在的異硫氰酸酯類物質(zhì)的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用［7］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)SFN可保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境致癌物的侵害，并誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞生長停滯和（或）凋亡，如抑制非肌肉浸潤性膀胱癌、卵巢癌和胃癌干細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［8-10］。本研究以人黑色素瘤細(xì)胞株A375為研究對象，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)SFN呈劑量依賴式抑制A375細(xì)胞增殖，與上述文獻(xiàn)報道一致。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)不依賴于半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶的程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞內(nèi)多余的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等成分在溶酶體內(nèi)分解的復(fù)雜的催化過程，又被稱為Ⅱ程序性細(xì)胞死亡［11］。其中，LC3是自噬體的標(biāo)志蛋白，其蛋白合成后可被Atg4剪切，形成LC3Ⅰ；而在自噬過程中，LC3Ⅰ經(jīng)Atg7和Atg3等泛素酶系統(tǒng)加工修飾，形成分子量為14 kDa的LC3Ⅱ，并定位到自噬小體中，因此自噬活化時，細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅰ會向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化［12］。Beclin-1作為自噬過程的關(guān)鍵基因，是自噬所需Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶復(fù)合物的一部分。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，細(xì)胞內(nèi)的Beclin-1 mRNA和蛋白表達(dá)均增加［13］。p62是選擇性自噬受體，在自噬過程中與泛素化蛋白結(jié)合，最終被清除。p62水平升高表示對自噬體的清除被阻斷，當(dāng)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ上調(diào)時，p62下調(diào)，表明自噬正在進(jìn)行，反之表示自噬過程被抑制［14］。因此，分析上述自噬相關(guān)分子的表達(dá)變化有助于反映細(xì)胞自噬水平。有研究報道SFN能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，發(fā)揮促凋亡作用［5］。在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，SFN可通過上調(diào)LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白以及下調(diào)p62蛋白表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬［4］。在人神經(jīng)瘤母細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)SFN可增加LC3Ⅱ蛋白表達(dá)而降低p62蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬流形成［15］。本研究采用不同濃度SFN處理人黑色素瘤A375細(xì)胞后，亦發(fā)現(xiàn)隨著SFN劑量的增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表達(dá)水平逐漸增強，p62表達(dá)水平逐漸降低；而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平逐漸下降，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白水平逐漸升高，說明SFN同樣可誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞發(fā)生自噬并促進(jìn)其凋亡。

目前也有研究報道SFN與自噬抑制劑聯(lián)合可能更好發(fā)揮抑癌作用。KANEMATSU等［16］研究發(fā)現(xiàn)SFN聯(lián)合自噬抑制劑巴伐洛霉素A1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。VYAS等［5］在前列腺癌細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)SFN聯(lián)合自噬抑制劑CQ可有效抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。CQ作為常用的自噬抑制劑之一，可作用于自噬過程的終末階段，同時通過影響溶酶體對自噬包裹物的降解抑制自噬，且被報道與其他藥物聯(lián)合作用可能有助于進(jìn)一步抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖［17］。為進(jìn)一步分析SFN誘導(dǎo)的自噬對A375細(xì)胞增殖的影響，本研究采用自噬抑制劑CQ預(yù)處理A375細(xì)胞后分別加入不同濃度的SFN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純CQ預(yù)處理A375細(xì)胞并未引起細(xì)胞增殖率明顯變化，提示A375細(xì)胞在正常情況下自噬水平可能較低，對細(xì)胞增殖活力無明顯影響，但CQ聯(lián)合SFN處理后可進(jìn)一步增強細(xì)胞增殖抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，SFN可誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞發(fā)生自噬并促進(jìn)其凋亡，且與自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用能更有效抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，為黑色素瘤的聯(lián)合治療提供新的策略。但是本研究僅在A375細(xì)胞中驗證，且未進(jìn)行體內(nèi)動物實驗研究，因此SFN誘導(dǎo)自噬及聯(lián)合自噬抑制劑對黑色素瘤的確切作用及其機制仍有待進(jìn)一步研究。