基于生物信息學(xué)分析RSK1在乳腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

劉司南 龍?jiān)葡?高潔 王錚， 劉昌， 黃啟超 林婷

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居全球癌癥相關(guān)性死亡原因的第二位［1］。因此，對(duì)乳腺癌患者總體預(yù)后的研究有重要意義，其中循環(huán)腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后中的價(jià)值也成為研究的方向之一［2］。核糖體 S6蛋白激酶（ribosomal S6 protein kinase，RSK）家族是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）的重要效應(yīng)因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖和存活等關(guān)鍵過程［3］。有研究發(fā)現(xiàn)RSK1具有抗癌和促癌雙重作用。然而，RSK1在乳腺癌中的作用尚存爭(zhēng)議［4］。ZHAO 等［5］檢測(cè) RSK1、RSK2 和RSK3蛋白在乳腺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)RSK1在乳腺癌組織中低表達(dá)。然而，SMITH等［6］研究卻發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，乳腺腫瘤組織中RSK1表達(dá)水平升高約50%。而且目前RSK1對(duì)乳腺癌患者總體預(yù)后影響的相關(guān)研究較少。本研究通過基于大樣本乳腺癌基因組及蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，分析RSK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者總體預(yù)后的影響，探討其作為乳腺癌總體預(yù)后標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

乳腺癌患者基因表達(dá)相關(guān)數(shù)據(jù)來源于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集及GEO數(shù)據(jù)集。其中，TCGA數(shù)據(jù)通過TCGAAssembler 2.0.6軟件從癌癥和腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載，共納入1 089例乳腺癌患者RNA-seq測(cè)序結(jié)果，其中女性1 077例，男性12例；中位年齡58歲（范圍：49～68歲）；Ⅰ～Ⅱ期 800例（73.5%），Ⅲ～Ⅳ期266例（24.4%）。GEO數(shù)據(jù)集共納入9個(gè)獨(dú)立研究（GSE20685、GSE3494、GSE7390、GSE1456、GSE45255、GSE16446、GSE42568、GSE20711 和 GSE37946），共計(jì)1 393例乳腺癌樣本。上述9個(gè)GEO數(shù)據(jù)集均基于Affymetrix基因芯片平臺(tái)。同時(shí)，從TCGA-RPPA蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得RSK1蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)。從Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)獲取腫瘤以及正常組織中RSK1蛋白免疫組化染色數(shù)據(jù)。

從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取患者基本信息、總生存期（overall survival，OS）以及生存狀態(tài)。去除生存時(shí)間不正確或缺失數(shù)據(jù)，以及非乳腺癌患者數(shù)據(jù)，最終將上述臨床信息與乳腺癌標(biāo)本生物學(xué)數(shù)據(jù)匹配。以RSK1表達(dá)中位數(shù)作為截點(diǎn)值將患者分為RSK1高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者總體預(yù)后。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Stata 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類數(shù)據(jù)采用n（%）表示。分類資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。生存曲線分析采用Kaplan-Meier，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型分析RSK1與乳腺癌患者OS的關(guān)系，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其對(duì)應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)分析RSK1蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)

Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)的RSK1免疫組化染色結(jié)果顯示，RSK1蛋白主要表達(dá)于乳腺上皮細(xì)胞，并且在乳腺癌組織中表達(dá)水平較低，見圖1。

圖1 RSK1蛋白在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of RSK1 protein in breast cancer tissues and normal tissues

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析RSK1 mRNA以及蛋白表達(dá)水平與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系

2.2.1 RSK1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 以O(shè)S為終點(diǎn)事件，以RSK1 mRNA表達(dá)中位數(shù)9.89為截?cái)嘀祵⒒颊叻譃镽SK1 mRNA低表達(dá)組（545例）和RSK1 mRNA高表達(dá)組（544例）。其中RSK1 mRNA表達(dá)與患者的HER2基因表達(dá)水平及N分期（區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、臨床分期、病理類型等均無關(guān)（P＞0.05），見表 1。

表1 RSK1 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between RSK1 mRNA expression and clinicopathological characteristics of breast cancer patients［n（%）］

2.2.2 生存分析 基于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析結(jié)果顯示，RSK1 mRNA高表達(dá)和低表達(dá)乳腺癌患者的中位生存時(shí)間分別為148.5個(gè)月和113.6個(gè)月，高表達(dá)患者總體預(yù)后較好（HR=0.650，95% CI：0.47～0.89，P=0.007），見圖2A。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，女性、年齡≤60歲、Ⅰ～Ⅱ期、浸潤(rùn)性乳腺癌、無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）以及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M0）的患者RSK1 mRNA高表達(dá)時(shí)預(yù)后較好，見表2?；赥CGA-RPPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析407例有RSK1蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)的乳腺癌患者總體預(yù)后信息，結(jié)果顯示，RSK1蛋白高表達(dá)患者的總體預(yù)后優(yōu)于RSK1低表達(dá)患者（HR=0.49，95% CI：0.27～0.89，P=0.011），見圖 2B。

圖2 RSK1表達(dá)與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between RSK1 expression and overall survival in patients with breast cancer

基于TCGA-BRCA以及TCGA-RPPA數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)早期（Ⅰ～Ⅱ期）和晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者RSK1 mRNA和蛋白表達(dá)與總體預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分層分析。結(jié)果顯示，早期患者中RSK1 mRNA高表達(dá)組總體預(yù)后較好（HR=0.61，95% CI：0.39～0.95，P=0.025）；RSK1 蛋白高表達(dá)組總體預(yù)后亦優(yōu)于低表達(dá)組（HR=0.43，95% CI：0.22～0.84，P=0.008）。而晚期乳腺癌患者中，RSK1 mRNA和蛋白高表達(dá)和低表達(dá)患者的總體預(yù)后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=1.03，95% CI：0.74～1.43，P=0.87；HR=0.89，95% CI：0.45～1.74，P=0.72）。

2.2.3 RSK1 mRNA與乳腺癌患者OS的關(guān)系 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、臨床分期、T分期、N分期、RSK1 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者OS有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡＞60歲（HR=2.149，95% CI：1.487～3.108，P＜0.001）、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期（HR=2.663，95% CI：1.547～4.586，P＜0.001）是影響乳腺癌患者OS的危險(xiǎn)因素，而RSK1 mRNA高表達(dá)（HR=0.621，95% CI：0.425～0.907，P=0.014）是影響乳腺癌患者OS的保護(hù)因素。見表3。

2.3 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析RSK1 mRNA與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系

9個(gè)GEO芯片數(shù)據(jù)薈萃分析顯示，RSK1 mRNA高表達(dá)組患者總體預(yù)后較好（HR=0.69，95% CI：0.56～0.86，P=0.002），與TCGA-BRCA數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的9個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示7項(xiàng)研究中高表達(dá)RSK1的患者預(yù)后較好，但只有樣本量大于300的GSE20685研究差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而GSE1456數(shù)據(jù)和GSE16446數(shù)據(jù)研究中高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)者差（HR=1.38，95% CI：0.73～2.63，P=0.304；HR=8.40，95% CI：2.96～23.9，P=0.012）。見圖3～4。

表2 乳腺癌患者RSK1 mRNA表達(dá)與OS的分層分析Tab.2 Stratified analysis of RSK1 mRNA expression and OS in breast cancer patients

表3 影響乳腺癌患者OS的單因素及多因素分析Tab.3 Univariable and multivariable analysis of prognostic factors for OS in breast cancer patients

圖3 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中RSK1 mRNA表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Relationship between the expression of RSK1 mRNA and the prognosis of breast cancer in the GEO database

圖4 RSK1 mRNA表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Relationship between the expression of RSK1 mRNA and the prognosis of breast cancer

3 討論

RSK 家族包括 RSK1、RSK2、RSK3 和 RSK4，其中，RSK1-3 mRNA在所有細(xì)胞系和組織中表達(dá)，而RSK4 mRNA主要在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)［3］。該家族具有高度保守的功能基序和序列同源性，含有N端激酶結(jié)構(gòu)域（NTKD）和C端激酶結(jié)構(gòu)域（CTKD），前者可調(diào)節(jié)RSK的激活，而后者負(fù)責(zé)底物磷酸化。RSK可調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和增殖有關(guān)的底物，但是既往研究中關(guān)于RSK1在乳腺癌中的作用并不一致。部分研究顯示RSK1發(fā)揮促癌作用，CZAPLINSKA等［7］構(gòu)建三陰性乳腺癌小鼠模型，觀察腫瘤的生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移的形成情況，結(jié)果35 d后發(fā)現(xiàn)所有接種對(duì)照細(xì)胞的小鼠均成瘤，而在注射RSK1陰性細(xì)胞組中僅有75%的荷瘤小鼠，且RSK1陰性小鼠的平均腫瘤質(zhì)量明顯較陽性小鼠降低（0.37 g vs 1.16 g，P＜0.0001），RSK1陰性小鼠在肺表面的轉(zhuǎn)移灶亦減少了約85%（P＜0.001），說明RSK1促進(jìn)了不依賴錨定的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。LUDWIK等［8］在三陰性乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)中，癌細(xì)胞增殖、存活和運(yùn)動(dòng)均需要RSK的參與，沉默或抑制RSK1可抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和定植。后續(xù)研究中報(bào)告了一種新型RSK1/2抑制劑SL0101類似物，認(rèn)為沉默RSK1和RSK2可進(jìn)一步抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞系存活或增殖能力。還有研究發(fā)現(xiàn)在基底樣乳腺癌中，RSK1可激活Y-Box結(jié)合蛋白-1（Y-box binding protein-1，YB-1）［9］，而 YB-1 已被證明在基底樣乳腺癌中的表達(dá)比例較高［10］，且與乳腺癌高復(fù)發(fā)率有關(guān)［11］，在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)可導(dǎo)致單層細(xì)胞增殖和錨定非依賴性生長(zhǎng)增強(qiáng)［12］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制RSK可通過滅活三陰性乳腺癌中的YB-1消除腫瘤起始細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［13］。然而，也有相關(guān)研究認(rèn)為RSK1具有抗腫瘤作用。LARA等［14］報(bào)道RSK1是非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的負(fù)調(diào)節(jié)劑，在繼發(fā)性病變與原發(fā)性病變中，RSK1表達(dá)降低，且敲低RSK1可增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力（RSK2和RSK4的敲低具有相反作用），并導(dǎo)致A549肺癌細(xì)胞在體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移。ZHAO等［5］發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中RSK1表達(dá)下調(diào)，且RSK1轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤等級(jí)、TNM分級(jí)和分期呈負(fù)相關(guān)。本研究基于TCGA、GEO以及Protein Atlas數(shù)據(jù)分析RSK1在乳腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示乳腺癌組織中RSK1蛋白表達(dá)水平低于正常乳腺組織，且TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析RSK1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RSK1 mRNA表達(dá)與HER2基因表達(dá)水平及N分期（區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)，且高表達(dá)患者的預(yù)后較好，進(jìn)一步的Cox回歸分析同樣顯示RSK1 mRNA高表達(dá)是預(yù)后的保護(hù)因素。進(jìn)一步分層分析亦發(fā)現(xiàn)在女性、年齡≤60歲、Ⅰ～Ⅱ期、浸潤(rùn)性乳腺癌、無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）以及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M0）患者中RSK1 mRNA高表達(dá)是保護(hù)因素?；赥CGA-RPPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析RSK1蛋白高低表達(dá)患者的生存情況，也支持RSK1高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后的保護(hù)因素這一結(jié)論。因此認(rèn)為，RSK1有望成為乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。

但是，本研究結(jié)論與上述部分研究［7-14］結(jié)果有所差異，分析可能原因是上述研究更多為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探索，同時(shí)缺乏大樣本臨床研究驗(yàn)證，因此可能導(dǎo)致以往研究未發(fā)現(xiàn)RSK1對(duì)乳腺癌總體預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。本研究中納入的 7 項(xiàng)（GSE20685、GSE3494、GSE7390、GSE45255、GSE42568、GSE20711 和 GSE37946） 研究均支持高表達(dá)RSK1是乳腺癌總體預(yù)后保護(hù)因素，但是也只有樣本量大于300例的GSE20685研究得到統(tǒng)計(jì)學(xué)陽性結(jié)果，一定程度上也說明樣本量可能是造成陰性結(jié)果的原因。本研究還發(fā)現(xiàn)RSK1高表達(dá)可作為早期乳腺癌患者的預(yù)后保護(hù)因素，而在晚期患者中，RSK1低表達(dá)組預(yù)后較好，但也未能得到陽性的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。因此，盡管本研究基于大樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，但是納入的乳腺癌樣本大部分基于歐美人群，且單一指標(biāo)對(duì)乳腺癌總體預(yù)后評(píng)估有限，同時(shí)也還缺乏大樣本的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證，因此本研究結(jié)果是否適用于我國(guó)乳腺癌患者，以及后期聯(lián)合其他指標(biāo)是否能進(jìn)一步提高總體預(yù)后評(píng)估價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。