馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響

歐海玲 張秀玲 孫平良 張錫流耿曙光 覃宇周

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位，死亡率居第二位［1］。手術(shù)、化療是胃癌的常用治療手段，但患者的總體治療效果并不理想，5年生存率為25%～30%［2］，其中約50%的患者最終因腹腔種植轉(zhuǎn)移死亡［3］。因此，尋找新的治療藥物和治療途徑是胃癌研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，天然植物中的多糖成分由于其抗腫瘤作用具有高效低毒的特點(diǎn)而越來(lái)越受到重視。馬齒莧多糖與其他植物多糖一樣，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，除了具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化等作用外，還具有殺滅肝癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞作用［4-6］。本研究主要探討馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為尋求新的胃癌治療藥物提供基礎(chǔ)理論和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及主要試劑與設(shè)備

胃癌SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；馬齒莧多糖由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提取和分離；5-氟尿嘧啶（5-FU）購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Bioswamp公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州金凈凈化設(shè)備公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器、酶標(biāo)儀均購(gòu)自Thermo公司；顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 胃癌SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)，取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞至適當(dāng)濃度后移入新的培養(yǎng)瓶中，3～4 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)分為馬齒莧多糖組、陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組（5-FU組），其中馬齒莧多糖組濃度依次為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL。

1.2.2 MTT法檢測(cè)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖情況 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為 2×105/mL，接種于96 孔板中，置于37 °C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后處理細(xì)胞，馬齒莧多糖組加入相應(yīng)濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）的馬齒莧多糖液，陰性對(duì)照組加入0.9% NaCl溶液，5-FU組加入2.5 μg/mL濃度的5-FU，分別處理 12 h、24 h、36 h、48 h；吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液，再加20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；再次吸去上清液，每孔加入150 μL Formazan溶解液，搖床上低速振蕩10 min，然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值（OD）并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀況良好的胃癌SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，待單層細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，按組處理細(xì)胞，馬齒莧多糖組加入相應(yīng)濃度的馬齒莧多糖液，陰性對(duì)照組加入0.9% NaCl溶液，5-FU組加入2.5 μg/mL濃度的5-FU，分別處理 12 h、24 h、36 h、48 h；收集細(xì)胞，離心棄上清液，PBS 洗滌 3 次；加入 10 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以藥物作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率以計(jì)量資料［均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）］表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Scheffe法檢驗(yàn)。細(xì)胞凋亡率組間比較采用χ2檢測(cè)，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 的馬齒莧多糖均可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞增殖（P＜0.05），且細(xì)胞增殖抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的提高而升高，其中藥物作用48 h時(shí)，各濃度馬齒莧多糖組的增殖抑制率均較前明顯增加，其中200 μg/mL、300 μg/mL馬齒莧多糖組增殖抑制率與5-FU組相當(dāng)（P＞0.05）。見(jiàn)表 1和圖 1。

表1 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

表1 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

aP＞0.05，vs the 5-FU group；bP＜0.05，vs the 5-FU group；cP＜0.05，vs thenegative control group

Proliferation inhibition rate（%）12 h 24 h 36 h 48 h Negative control 0 0 0 0 Group 5-FU 13.83±2.94c 29.83±3.54c 42.89±3.45c 56.36±3.26c 25 μg/mL 2.17±1.27bc 20.51±1.24bc28.35±1.49bc 38.01±1.33bc 50 μg/mL 10.23±2.58bc 24.05±4.56bc34.01±2.46bc 41.05±3.85bc 100 μg/mL 16.98±1.28ac 32.39±1.34bc42.85±5.57ac 51.05±1.57bc 200 μg/mL 24.01±4.76bc 37.01±3.28bc48.65±2.06bc 53.02±2.46ac 300 μg/mL 28.57±2.13bc 42.01±1.34bc51.99±1.04bc 57.20±2.14ac

圖1 不同濃度馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the proliferation of gastric cancer SGC7901 cells

2.2 馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物作用48 h時(shí)，陰性對(duì)照組和5-FU組細(xì)胞凋亡率分別為0.73%和47.39%，不同濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 馬齒莧多糖組細(xì)胞凋亡率依次為 31.92%、38.39%、40.45%、48.49%、55.71%。與陰性對(duì)照組比較，各濃度馬齒莧多糖組的細(xì)胞凋亡率均明顯升高（均P＜0.05），且隨著馬齒莧多糖濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸上升；與5-FU組比較，200 μg/mL濃度組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 組細(xì)胞凋亡率降低，而 300 μg/mL組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

表2 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細(xì)胞的凋亡率（%）Tab.2 The apoptosis rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（%）

3 討論

我國(guó)胃癌具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高，而早診率低的特點(diǎn)，化療是胃癌綜合治療方案的重要組成部分，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常組織造成傷害，致使部分患者難以耐受其毒性作用而終止治療，治療效果受到明顯影響。近年來(lái)，從天然植物中提取多糖類物質(zhì)用于抗腫瘤活性的研究已有不少報(bào)道。植物多糖作為生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，主要通過(guò)增強(qiáng)凋亡途徑、氧化呼吸功能途徑和體內(nèi)的免疫應(yīng)答等殺傷腫瘤細(xì)胞［7］，對(duì)正常組織損傷較小。因此，若能篩選對(duì)胃癌細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)的植物多糖，則有望改善胃癌的治療效果。

圖2 48 h后不同濃度馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells after 48h

馬齒莧屬馬齒莧科植物，廣泛分布在熱帶、溫帶地區(qū)，為藥食同源的野生植物，含有豐富的化學(xué)成分，包括生物堿、黃酮類、有機(jī)酸、苷類、萜類、多糖等。藥理研究顯示馬齒莧具有降血脂、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌、抗氧化、防衰老、增強(qiáng)免疫以及抗腫瘤等作用［8-10］。其中馬齒莧多糖便是有效的活性成分之一，目前也有少量研究初步探討對(duì)馬齒莧多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。胡慶娟等［5］研究報(bào)道馬齒莧多糖可顯著降低肝癌HepG2細(xì)胞存活率，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。牛廣財(cái)?shù)龋?1］也發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ均能顯著抑制荷Lewis肺癌小鼠的瘤體生長(zhǎng)，且可提高荷Lewis肺癌小鼠NK細(xì)胞及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的活性。在宮頸癌移植瘤中也發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠抑制移植瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［12］；且能增強(qiáng)宮頸癌荷瘤小鼠細(xì)胞免疫功能，對(duì)小鼠U14宮頸癌實(shí)體瘤和腹水瘤可發(fā)揮抑制作用［6，13］。但馬齒莧多糖與胃癌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究用馬齒莧多糖液干預(yù)胃癌SGC7901 細(xì)胞 48 h 后，發(fā)現(xiàn) 200 μg/mL、300 μg/mL馬齒莧多糖組增殖抑制率可達(dá)（53.02±2.46）%、（57.20±2.14）%，而一般抑制率＞30%則認(rèn)為抗腫瘤有效，因此提示在胃癌中馬齒莧多糖同樣顯示了可抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果，與上述研究結(jié)果一致。此外，因5-FU是目前臨床上用于消化道腫瘤化療的有效藥物之一，本研究進(jìn)一步采用5-FU作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上濃度馬齒莧多糖處理與5-FU處理的細(xì)胞增殖抑制率相當(dāng)，再次說(shuō)明高濃度馬齒莧多糖的抑瘤活性與5-FU相當(dāng)。本研究還發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖組隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，處理48 h，300 μg/mL馬齒莧多糖組的胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡率達(dá)到55.71%，明顯高于5-FU組的47.38%，說(shuō)明馬齒莧多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤目的。目前也有研究報(bào)道馬齒莧多糖通過(guò)降低線粒體膜電位、增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、提高p53和Bax的基因及蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。但是，馬齒莧多糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未知，有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。