miR-6732-3p對(duì)鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R放射敏感性的影響

楊曉慧 李開(kāi)國(guó) 朱小東 李齡 杜有芹 楊柳 曲頌

鼻咽癌是一種起源于鼻咽上皮組織的惡性腫瘤［1］。雖然鼻咽癌在全球范圍內(nèi)并不屬于常見(jiàn)腫瘤，但我國(guó)的鼻咽癌發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平，且我國(guó)鼻咽癌發(fā)病率和死亡率較高的區(qū)域主要集中在南方，尤其是兩廣地區(qū)（廣西和廣東）［2］。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段及根治性治療的重要組成部分。然而即使經(jīng)過(guò)積極有效的治療，仍然約有20%的鼻咽癌患者發(fā)生局部腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［3］。研究認(rèn)為放射抗拒是導(dǎo)致鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因之一［4］。目前有大量研究表明放射抗拒的發(fā)生可能與microRNAs的異常表達(dá)有關(guān)［4-6］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-6732-3p在放射抗拒組和放射敏感組鼻咽癌患者血清中的相對(duì)表達(dá)量有明顯差異，且認(rèn)為hsa-miR-6732-3p可作為評(píng)估鼻咽癌放射敏感性的生物標(biāo)志物，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值［7］?；诒菊n題組的前期研究結(jié)果，為了進(jìn)一步明確miR-6732-3p表達(dá)與鼻咽癌放射敏感性的關(guān)系，本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R中miR-6732-3p的表達(dá)，探討沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鼻咽癌低分化細(xì)胞株CNE-2購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R由本實(shí)驗(yàn)室前期在CNE-2細(xì)胞基礎(chǔ)上通過(guò)分次照射的方法誘導(dǎo)構(gòu)建并保存［8］；miR-6732-3p慢病毒表達(dá)載體由GenePharma公司合成并構(gòu)建。胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液等試劑均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；1%青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶消化液等試劑均購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA First Strand cDNA Synthesis試劑盒、RT-qPCR引物設(shè)計(jì)合成及2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojino公司；Annexin V-APC/7-AAD試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司；4%多聚甲醛固定液和姬姆薩染液購(gòu)于中國(guó)索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 CNE-2R細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（CNE-2R）、轉(zhuǎn)染對(duì)照組（miR-6732-3p NC）、轉(zhuǎn)染組（miR-6732-3p inhibition）。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE-2R細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入慢病毒濃縮液，轉(zhuǎn)染12 h后，棄上清，更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。利用嘌呤霉素篩選出轉(zhuǎn)染成功的CNE-2R細(xì)胞。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-6732-3p的表達(dá) 用Trizol提取細(xì)胞總RNA，按miRNA First Strand cDNA Synthesis試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒和熒光定量PCR儀檢測(cè)各組Ct值，選擇U6作為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)量3次，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 參考CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以 100 μL/孔（2×103個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在0 d（細(xì)胞貼壁后）、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 檢測(cè)各組細(xì)胞活性，吸出舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8混合液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值。以各時(shí)間點(diǎn)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。然后，檢測(cè)三組細(xì)胞的放射敏感性，將細(xì)胞以2×103/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組根據(jù)不同照射劑量（0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy）分成5個(gè)亞組，待細(xì)胞貼壁后用6 MV-X射線給予相應(yīng)劑量照射，照射結(jié)束繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后檢測(cè)各組細(xì)胞活性，檢測(cè)方法同上。以存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）評(píng)估每組細(xì)胞的放射敏感性，SF=ODnGy/OD0Gy。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞融合度約為40%的細(xì)胞每組各兩瓶，每組各取1瓶接受0 Gy和8 Gy射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至相應(yīng)離心管中，PBS洗滌2次；用0.5 mL 1×Binding Buffer制備單細(xì)胞懸液；每管先后加入5 μL Annexin V-APC及5 μL 7-AAD試劑，室溫避光孵育15 min，每管加入300 μL Binding Buffer混勻。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù) 收集各組細(xì)胞并接種于6孔板中，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔。給予貼壁細(xì)胞單次射線照射，照射劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy，接種細(xì)胞數(shù)分別對(duì)應(yīng)為 200/孔、200/孔、400/孔、600/孔、800/孔，照射后靜止培養(yǎng) 10～14 d。采用4%多聚甲醛固定液固定和姬姆薩染液染色后使用顯微鏡計(jì)數(shù)集落數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞數(shù)為有效集落）。計(jì)算不同劑量照射下的細(xì)胞SF值，計(jì)算公式如下：克隆形成率（plating efficiency，PE）=克隆數(shù)/種植細(xì)胞數(shù)；SF=PEnGy/PE0Gy，PEnGy代表受照射細(xì)胞的PE，PE0Gy代表未受照射細(xì)胞的PE。用單擊多靶模型擬合劑量-存活曲線，并計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq及SF2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步的多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。放射生物學(xué)參數(shù)和細(xì)胞存活曲線使用GraphPad Prism 5擬合。本研究中的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-6732-3p在CNE-2和CNE-2R細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與CNE-2細(xì)胞相比，miR-6732-3p在CNE-2R細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高（1.00±0.00 vs 2.43±1.22，t=-2.855，P=0.036），見(jiàn)圖 1。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞并驗(yàn)證其表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染CNE-2R細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下均觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的綠色熒光蛋白陽(yáng)性率均達(dá)到80%以上，見(jiàn)圖2B。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，3組細(xì)胞中miR-6732-3p的相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），其中轉(zhuǎn)染組與正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.376，P＜0.001；t=4.310，P=0.006），而兩對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.884，P=0.427），見(jiàn)圖3。

圖1 miR-6732-3p在CNE-2和CNE-2R細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-6732-3p in CNE-2 and CNE-2R cells

圖2 CNE-2R細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染率Fig.2 Lentivirus infection rates in CNE-2R cell

圖3 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-6732-3p的表達(dá)Fig.3 Expression of miR-6732-3p in each group cells aftertransfection detected by RT-qPCR

2.3 沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，三組細(xì)胞的增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=305.373，P＜0.001），其中轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力均低于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P＜0.001），且正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.105），見(jiàn)圖4A。在不同照射劑量下三組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=50.789，P＜0.001），其中在不同照射劑量下轉(zhuǎn)染組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯小于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P＜0.001），且兩對(duì)照組間細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.192），見(jiàn)圖4B。

圖4 沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of silencing miR-6732-3p on the proliferation of CNE-2R cells

2.4 沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞凋亡的影響

未照射（0 Gy）時(shí)，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率略增加，其中正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.85±0.54）%，（4.56±0.35）%和（5.69±0.22）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.714，P=0.004），而正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.907，P=0.129）；接受8 Gy劑量照射后，三組細(xì)胞凋亡率分別為（7.99±1.06）%、（7.49±3.47）%和（19.74±1.21）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.581，P=0.001），見(jiàn)圖 5。

2.5 沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響

采用不同劑量射線照射后，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆數(shù)均少于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組，見(jiàn)圖6A。采用單擊多靶模型擬合三組細(xì)胞的劑量-存活曲線，結(jié)果顯示，各照射劑量下，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)均低于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=240.256，P＜0.001），見(jiàn)圖 6B。放射生物學(xué)參數(shù)中，正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的D0、Dq和SF2值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.025，P=0.981；t=1.423，P=0.228；t=-0.011，P=0.991），但與轉(zhuǎn)染組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖7?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果提示沉默miR-6732-3p可提高CNE-2R細(xì)胞的放射敏感性。

圖5 不同處理組細(xì)胞接受0 Gy和8 Gy照射后的細(xì)胞凋亡率Fig.5 The changes of apoptosis rate in different treatment groups after 0 Gy and 8 Gy irradiation

圖6 沉默miR-6732-3p對(duì)CNE-2R細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.6 Effects of miR-6732-3p silencing on radio-sensitivity of CNE-2R cells

圖7 不同處理組細(xì)胞單擊多靶模型的放射生物參數(shù)Fig.7 The radiobiological parameters of single-hit multi-target model in different treatment groups

3 討論

microRNAs（miRNAs）是一類長(zhǎng) 18～25 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其作用機(jī)制是通過(guò)降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯，使基因在轉(zhuǎn)錄水平后沉默，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、周期和腫瘤血管生成，參與放射抗拒［9］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系［10-12］，尤其在miRNAs調(diào)節(jié)鼻咽癌放射敏感性方面已有較多報(bào)道。ZHU等［13］采用高通量測(cè)序技術(shù)篩選了鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2和由其誘導(dǎo)構(gòu)建的放射抗拒細(xì)胞株CNE-2-1細(xì)胞中的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miRNA-21可增強(qiáng)鼻咽癌放射敏感性。同樣地，LI等［14］用microRNA基因芯片檢測(cè)了CNE-2和CNE-2R細(xì)胞的miRNAs譜，也發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-210表達(dá)可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的輻射敏感性。周蘇娜等［15］在放射抗拒的鼻咽癌細(xì)胞及臨床標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)miRNA-381表達(dá)量更高。本團(tuán)隊(duì)前期研究中選擇鼻咽癌放射抗拒性患者和放射敏感性患者血清作為樣本，并利用基因芯片技術(shù)成功篩選了血清中miRNAs差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-6732-3p在兩組患者血清樣本中的表達(dá)存在明顯差異［7］。根據(jù)前期初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究進(jìn)一步對(duì)CNE-2與CNE-2R細(xì)胞中miR-6732-3p的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)miR-6732-3p在兩種鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)量存在明顯差異。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞乏氧、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡及DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，本質(zhì)是相關(guān)基因在應(yīng)對(duì)射線時(shí)的生物反應(yīng)不同，與放射生物效應(yīng)過(guò)程相關(guān)的各種基因變異、基因多態(tài)性及表觀修飾等均可造成放射敏感性的差異［16］。為了觀察miR-6732-3p對(duì)鼻咽癌放射敏感性的影響，本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默CNE-2R細(xì)胞中miR-6732-3p的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的變化。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-6732-3p可使CNE-2R細(xì)胞增殖受抑制，同時(shí)提高了CNE-2R細(xì)胞的放射敏感性，因此推測(cè)miR-6732-3p可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖而提高細(xì)胞的放射敏感性。

凋亡又稱程序性死亡，當(dāng)細(xì)胞受到各種信號(hào)刺激后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄凋亡相關(guān)基因從而導(dǎo)致細(xì)胞自殺死亡的過(guò)程。凋亡也是細(xì)胞受到輻射后的主要死亡方式。有研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞放射敏感性與放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［17］。本研究流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，鼻咽癌細(xì)胞在接受0 Gy和8 Gy劑量的射線照射后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組升高，8 Gy劑量照射下細(xì)胞凋亡更顯著，進(jìn)一步下調(diào)miR-6732-3p發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)CNE-2R細(xì)胞放療敏感性，說(shuō)明miR-6732-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而影響鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。細(xì)胞劑量-存活曲線是放射生物學(xué)中的重要參數(shù)，D0為平均致死量，指在存活曲線的直線部分把存活分?jǐn)?shù)從0.1降到0.037或從0.01降到0.0037所需的劑量，反映的是不同或同一細(xì)胞對(duì)放射敏感性的變化，D0值越小說(shuō)明細(xì)胞對(duì)射線越敏感。而Dq為準(zhǔn)閾劑量，反映細(xì)胞亞致死性損傷修復(fù)能力的大小，Dq越小說(shuō)明細(xì)胞修復(fù)能力越小，對(duì)輻射越敏感。SF2為2 Gy時(shí)的存活分?jǐn)?shù)。本研究分析各組細(xì)胞單擊多靶模型的放射生物參數(shù)，結(jié)果轉(zhuǎn)染組細(xì)胞D0、Dq和SF2值均小于兩個(gè)對(duì)照組，說(shuō)明miR-6732-3p的表達(dá)量高低可影響鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。

綜上所述，本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默miR-6732-3p可顯著提高鼻咽癌CNE-2R細(xì)胞的放射敏感性，但是miR-6732-3p調(diào)節(jié)鼻咽癌放射敏感性的具體機(jī)制尚不明確，后續(xù)研究將進(jìn)一步預(yù)測(cè)其發(fā)揮作用的靶基因，并通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式深入探討其作用機(jī)制，為血清中miR-6732-3p成為鼻咽癌放射敏感性分子標(biāo)志物提供依據(jù)，從而為鼻咽癌放射增敏治療提供新的治療靶點(diǎn)。