相互作用熵方法在計算生物分子體系結合自由能中的發(fā)展和應用

段莉莉 黃開放 鐘素素

( 山東師范大學物理與電子科學學院,250358,濟南 )

1 引 言

作為構成生物的基礎物質，生物分子之間的相互作用在許多生命過程中起著核心作用.其中，蛋白質-蛋白質和蛋白質-小分子等分子之間的相互作用在控制基因表達，免疫反應，信號轉導和酶抑制等許多生物過程都起著重要作用.生命大分子一般由簡單的生物單分子重復聚合而成，如蛋白質由大量氨基酸脫水縮合而成，核酸由核苷酸聚合而成.而對生物大分子中相互作用的研究對于人們理解生命機理提供了可靠和直接的途徑.研究它們之間的相互作用機制是疾病治療和藥物研制的基礎.正常的生理活動都是一個動態(tài)過程，這意味著其中的生物大分子不僅整體都在運動，其內部也存在著相對運動，這給人們的研究帶來了極大的挑戰(zhàn).盡管對生物大分子的相互作用研究面臨著重重困難，但是這更激起了研究者的興趣，人們在這一領域的研究也已取得了矚目的進展.

通過X-ray表征生物大分子的三維結構為人們的研究奠定了基礎，這使得研究者能夠直觀的感受生物大分子的空間結構[1, 2].后來居上的核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)技術使得人們能更準確細致的獲取生物大分子的原子空間排布信息[3, 4].這些技術能將生物大分子表征出高分辨的三維結構，為研究者在原子層面上理解生物大分子之間的相互作用提供了化學基礎.但是這些實驗技術僅能提供生物大分子的靜態(tài)空間結構信息，很難對其中的相互作用進行進一步的研究；同時，高昂的實驗成本和漫長的實驗過程也增加了這些實驗方法的局限性.因此，采用理論方法來模擬生物大分子中的動態(tài)性質，對于理解其中的相互作用機理至關重要.

衡量生物大分子中的相互作用的強弱一般用結合自由能來描述，研究者根據不同的需要提出不同的理論方法用于結合自由能的計算.目前理論最嚴格和計算最精確的方法應屬自由能微擾(Free Energy Perturbation,FEP)[5, 6]和熱力學積分(Thermodynamic Integration,TI)[7, 8]，其計算準確性已經在一些應用中得到了驗證[9-27].這兩種方法存在的主要的缺陷是結合自由能在計算時收斂得非常慢，這就導致其需要巨大的計算資源[28].盡管近些年已經開發(fā)出使用GPU進行FEP和TI計算結合自由能的算法[29, 30]，但是這兩種方法依舊不適用在大規(guī)模的生物大分子體系中.在計算速度上占據著絕對優(yōu)勢的打分函數在藥物設計中虛擬篩選階段被廣泛使用，但是由于其較低的準確性一直被研究者謹慎對待[31-35].

1977年提出的分子動力學(Molecular Dynamics，MD)模擬運用勢能函數描述生物大分子中原子之間的相互作用，然后由牛頓運動方程求解原子的運動狀態(tài)，得到體系中每個原子的速度與位置隨時間演化的信息，成功重現了分子實際運動的動態(tài)微觀過程，為研究生物大分子構象變化的詳細信息以及系統(tǒng)的熱動力學性質提供了基礎[36].MD模擬不僅有助于人們在原子水平上理解生物大分子體系的動態(tài)物理過程，而且還可以揭示在實驗中難以檢測甚至不能檢測的構象.Kollman等人[37-39]借助MD能模擬出大量生物大分子構象的優(yōu)勢基礎上發(fā)展了分子力學結合連續(xù)性溶劑模型(Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann Surface Area，MM/PBSA; Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area，MM/GBSA)結合自由能計算方法，該方法在計算精度和計算成本上做到了很好的平衡，因此被廣泛地用于蛋白-蛋白、蛋白-配體、DNA-蛋白、RNA-蛋白和凝集素-糖之間的結合自由能的計算中.

MM/PB(GB)SA計算結合自由能的思想如圖1.路徑1描述的是實際中受體和配體中結合的方式：兩者處于液態(tài)環(huán)境中并結合成復合物，其中ΔGsolv，bind為我們所求的結合自由能.考慮到在液相中兩者結合的過程異常復雜，MM/PB(GB)SA模擬出路徑2用以簡化結合過程：配體與受體先在氣相中結合，然后將結合后的復合物置于液體中.從圖中可以看出.兩者的路徑始末狀態(tài)相同，則圖中的能量關系如下

(ΔGSolv,Rec+ΔGSolv,Lig)+ΔGsolv,bind=ΔGGas,bind+ΔGSolv,Comp

(1)

式中ΔGsolv，Rec、ΔGsolv，Lig和ΔGsolv，comp分別為氣象中的受體、配體和復合物進入液相中時溶劑化能的變化；ΔGsolv，bind和ΔGGas，bind分別為液相中氣相中的結合自由能.上式變形即可得結合自由能的公式

ΔGsolv,bind=ΔGGas,bind+ΔGSolv,Comp-(ΔGSolv,Rec+ΔGSolv,Lig)

(2)

通過該熱力學循環(huán)可以巧妙地避開液態(tài)環(huán)境中復雜的能量變化，使得生物大分子體系中的結合自由能的計算變得可行且簡便，這也正是MM/PB(GB)SA的優(yōu)勢所在.

圖1 MM/PB(GB)SA熱力學循環(huán)圖

在使用MM/PB(GB)SA計算結合自由能時，MD模擬過程中所使用的力場起著關鍵性的作用[40].張增輝等人[41]在2008年提出的蛋白質專一性極化電荷(Polarized Protein-specific Charge, PPC)力場，考慮了在傳統(tǒng)力場中忽略的重要的靜電極化效應，在計算蛋白質-蛋白質及蛋白質-配體小分子的相互作用中取得了突破性的進展，同時該方法也成功的折疊了一系列的蛋白，提高了傳統(tǒng)力場在研究蛋白質折疊的效率[42-47].Weis等人[48]比較了AMBER ff94/99/03力場對于MM/PBSA影響，研究表明三個力場對計算準確性的影響相似.侯廷軍等人[49]對AMBER ff99/99SB/99SB-ILDN/03/12SB力場研究后建議在MD模擬時和MM/PB(GB)SA計算時應使用相同的力場，而不應出現混搭情況.

通過MD模擬獲得了系統(tǒng)大量的構象采樣，然后進行結合自由能計算.目前MM/PB(GB)SA方法主要面臨兩個問題.其中一方面由于其本身參數化問題會導致計算結果與實驗結果有一定的偏差.侯廷軍等人[50]在2011年對MM/PB(GB)SA方法的性能進行了系統(tǒng)的評估，他們在研究中發(fā)現分子動力學模擬的時長、不同的內部介電常數以及不同的GB模型等，都對計算的結果有著敏感的影響.此后，他們通過對1 864個體系的測試發(fā)現MM/PB(GB)SA預測得到的結合親和力往往比實驗值更大，在某些體系中，采用較高的介電常數(如2或4)可以得到更好的結果[51].張增輝等人[52-54]通過測試大量實際體系中的不同介電常數對結合自由能的影響，發(fā)現對不同類型的氨基酸使用不同介電常數可以顯著提高計算結果的準確性.

另一方面，在MM/PB(GB)SA的計算中，熵貢獻通常采用傳統(tǒng)的正則模(Normal Mode， Nmode)分析方法來計算[55-58].但是此方法存在的一個弊端是采用諧振子近似來估算復合物結合過程中熵的變化.由于該理論將熵的貢獻分為平動熵、轉動熵以及振動熵，因此忽略了非諧貢獻，并且該方法計算量比較大[59-62].所以也無法適用特大分子體系中，因此許多研究者選擇忽略了熵的貢獻，這也導致計算結果更加不準確.為了解決目前熵變計算的困難，我們和張增輝教授課題組合作在2016年提出了相互作用熵方法(Interaction Entropy， IE)[63].該方法從MD模擬的軌跡中直接計算熵變，通過相互作用能的波動來衡量熵對結合自由能的貢獻.與Nmode相比，該理論有著如下的優(yōu)勢：IE方法是通過嚴格的理論推導而得到，并且IE的計算能遍歷MD中所有的構型，而Nmode一般只會抽樣整個相空間的幾十幀用于熵的計算，其次，盡管IE計算的構象要比Nmode多上數百倍，但是計算成本卻遠遠低于Nmode，這是由于其直接對每一幀構象的“氣相”中的相互作用進行計算，從而沒有多余附加的而計算.最后，該方法還為研究者理解熵對生物大分子中的相互作用的貢獻提供新的概念.鑒于該方法有諸多優(yōu)勢，IE的提出到現在也不過四年，但是研究者采用該方法去研究生物大分子的相互作用卻如雨后春筍.

2 相互作用熵在具體體系中的應用

2.1周期蛋白依賴性激酶2(Cyclin-dependentKinases2;CDK2)與配體相互作用機制的研究CDK2屬于CDK絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其主要生理功能是調控細胞周期中G1期至S期的轉換過程.CDK2結合Cyclin E或A后會磷酸化其Thr160殘基，從而通過磷酸化其底物促進上述周期轉換進程.CDK2的調控失衡會導致一系列后果，比如使細胞直接進入S或M期，從而導致細胞不受控分裂，即癌變.最近，一些研究發(fā)現CDK2也會參與細胞的分化當中[64].CDK2是腫瘤藥物設計的前景靶標，因而一直是人們研究的熱點.近些年，研究者發(fā)現水分子在蛋白質-配體之間的相互作用扮演者重要的角色，它能分別與蛋白質和配體形成氫鍵網絡從而加強蛋白質與配體結合的穩(wěn)定性[65].對于CDK2蛋白而言，其中的橋梁水分子對于蛋白質和抑制劑的調控作用往往被忽略.但是通過對眾多的CDK2復合物的晶體結構觀察發(fā)現，如圖2所示，該復合物中往往存在一個水分子(WAT145)，它既可以與CDK2的Asp145等殘基形成氫鍵，同時又能與抑制劑形成氫鍵，起到“橋梁”作用.現有的一些對于CDK2的分子動力學的研究都是基于非極化力場，這也許會導致因忽略CDK2、配體、水分子的極化效應而產生誤差.因此，極化作用和橋梁水的考慮將會對理解CDK2與抑制劑之間的相互作用提供一個新的視野.我們分別采用了蛋白質專一性極化電荷PPC和非極化力場AMBER研究了五個CDK2-配體的體系，同時針對橋梁水WAT145的影響進行了定量的分析[66].結果發(fā)現使用PPC力場進行動力學模擬，然后采用MM/PBSA結合IE方法計算它們之間的結合自由能能夠極大提高計算結果的精度，尤其是在考慮橋接水分子情況下，計算結果與實驗值的相關性達到0.98.而采用傳統(tǒng)的MM/PBSA結合Nmode方法計算結果與實驗值的相關性顯著降低.該項工作指出，CDK2中的Ile10、Val18、Lys33、Glu81、Phe82、Leu83、Leu134及Asp145殘基對橋接水分子、配體及CDK2激酶之間的結合起了非常重要的作用，橋接水分子WAT145與蛋白之間形成的氫鍵要比與配體之間形成的氫鍵更為穩(wěn)定.這些關鍵殘基與WAT145以及配體的相對位置如圖2所示.WAT145橋水的存在會極大的增強CDK2-配體之間的結合親和力，因此，該工作建議在藥物設計當中可以設計出類似與WAT145的官能團以增強蛋白-配體的結合[66].

圖2 CDK2體系晶體結構圖、橋水和關鍵殘基結構圖

2.2蛋白內部介電常數對HIV-1蛋白酶與配體相互作用的影響獲得性人類免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)作為一種嚴重危害生命的傳染病，在近些年來呈逐年增多的趨勢.該疾病是由于感染人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的.HIV蛋白酶是一種逆轉錄酶，其包含HIV-1和HIV-2兩種亞型.相比較而言，HIV-1因其傳播廣范而被人們廣泛研究.HIV-1一經進入人體后就能快速攻擊淋巴組織，感染其中的CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，從而使得人體喪失免疫功能.在計算HIV-1與抑制劑結合的復合物中，由于對溶質的介電常數無法進行精確的描述，所以導致MM/PB(GB)SA計算的結合自由能往往被高估.有研究表明，HIV-1的復合物中結合自由能的預測準確性要比其它復合物的要低，其主要原因是這些復合物與蛋白和抑制劑各形成兩根氫鍵的橋梁水WAT301和未計算熵的貢獻[67, 68].另外，其他的一些研究者在對HIV-1的研究中也遇到了計算結果不理想的狀況[69, 70].

為了更可靠的探究HIV-1蛋白酶與配體相互作用，我們分別在PPC力場和AMBER力場下研究了蛋白質內部介電常數對HIV-1與配體的結合自由能預測的影響[71].同時，由于橋梁水WAT301存在于大多數的HIV-1體系中，因此該橋梁水對于HIV-1結合配體的影響也在本文中被研究.該項工作表明，在計算結合自由能只考慮焓變的貢獻時，無論對于非極化的AMBER力場還是極化的PPC力場而言，改變蛋白質內部不同的介電常數不會對HIV-1與配體之間的結合自由能有太大的突破.盡管使用IE方法較Nmode能對預測結合自由能產生積極的影響，但當采用默認的介電常數1的時候所計算的結合自由能與實驗值的相關性仍低于0.6.研究發(fā)現采用較大的介電系數能提高計算的精度.當內部介電常數設置為1.4～1.6、使用MM/PBSA計算焓變以及IE方法計算熵時，所預測的結合自由能與實驗值的相關性達到0.84左右，且此時與實驗值的MAE也是處于最小.當介電常數設置為1.8～2.0，MM/GBSA預測能得到較為理想的結果.該項工作還表明，當考慮WAT301水分子貢獻時，能明顯提高預測HIV-1與配體的結合自由能的準確性[71].

2.3利用IE方法和MM/PBSA方法研究間變性淋巴瘤激酶突變后的抗藥性間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic Lymphoma Kinase,ALK)隸屬于胰島素受體超家族，是一個受體型蛋白質絡氨酸磷酸激酶.它調控著細胞的生長、分化、存活以及轉化[72].由于其在眾多的癌變中表現出異常的活性，因此ALK已成為一個治療癌癥的藥物靶點.ALK由N末端、C末端和鉸鏈環(huán)組成.在N末端中，存在CYS1156殘基連接著β-折疊和α-螺旋；而在包裹抑制劑的鉸鏈環(huán)中存在一個LEU殘基.一些研究表明C1156Y與L1198F的突變極大影響著ALK與配體的相互作用，從而導致不同程度的耐藥性[73-76].在過去的數十年中，由于ALK的變異已影響了三代抑制劑對肺癌的治療，研究發(fā)現對于5P8抑制劑，L1198F單變異以及C1156Y/L1198F雙變異已經產生了明顯的耐藥性；盡管C1156Y單變異能很好的被5P8治療，但是卻對VGH抑制劑有耐藥性；VGH對L1198F單變異有甚于野生態(tài)的治療效果.在與C1156Y有耐藥性的相互抵消下，VGH抑制劑對于C1156Y/L1198F雙變異體系有著和野生態(tài)幾乎相同的抑制效果[73-77].

基于這些復雜的耐藥機制，我們利用PPC力場和相互作用熵方法來研究ALK突變產生抗藥機制的原因[78].研究表明，在PPC力場下，ALK與配體之間形成氫鍵的穩(wěn)定性都高于非極化的AMBER力場.當發(fā)生突變時，ALK與配體的氫鍵穩(wěn)定性會減弱.C1156Y變異造成結合自由能增強的主要原因是其增強了ALK與5P8之間的vdW貢獻.盡管L1198F單變異也會導致復合物的vdW貢獻增強，但是其總的極性貢獻卻減弱的非常明顯.這導致當同時發(fā)生C1156Y和L1198F變異時，總的結合自由能減小.當然雙變異后復合物的熵也有所增加是使耐藥性增強的另外一個原因.對于另一種抑制劑VGH，C1156Y產生耐藥性是由于vdW項、靜電項的貢獻減弱且熵變大引起的.但是VGH卻能較理想的解決由L1198F單變異產生的抗藥性，這是由于L1198F變異加強了PHE1198和GLU197與VGH之間的vdW相互作用.當產生雙變異時，C1156Y變異產生的不利影響會與L1198F產生的有利影響相互抵消，這也解釋了實際中為何VGH治療C1156Y/L1198F雙變效果與野生態(tài)類似.該工作從最基本的相互作用力出發(fā)，詮釋C1156Y、L1198F和C1156Y/L1198F產生耐藥機制的原理，不僅給研究者治療ALK的耐藥機制提供了理論基礎，而且也對其它類似由變異產生的耐藥機制提供了一種可行準確的研究方法[78].

2.4相互作用熵在凝血酶蛋白-配體相互作用中的研究凝血酶是一種在凝血級聯(lián)反應結束時起著重要作用的絲氨酸蛋白酶.它主要負責在機體受到損傷時，將血漿中的可溶性纖維蛋白原轉變成不溶的纖維蛋白，然后通過纖維蛋白聚合形成的纖維網絡將血小板包裹起來，導致凝塊的形成和血流的停止[79-83].然而，一些重要的醫(yī)學疾病，如心肌缺血、腦血栓形成和心肌梗死等都與凝血酶有關.血栓栓塞性疾病是發(fā)達國家發(fā)病率和死亡率的主要來源，并且近年來發(fā)病率有上升的趨勢.有限的療效和出血性副作用減少了治療這些疾病的可用藥物的范圍.因此，尋找有效的凝血酶抑制劑是科研人員和醫(yī)務工作者面臨的一項艱巨而有意義的任務.

考慮到在以往對凝血酶體系的研究中，極化效應一直被忽略，熵變也因其計算的困難往往被忽略.我們對10個分別在凝血酶抑制劑的P2和P3側鏈進行修飾的凝血酶-小分子體系進行了結合機制的研究[84].研究結果表明，PPC力場結合新型的IE方法計算的結果與實驗值更加一致，相關性達到了0.91.相反地，無論在傳統(tǒng)的Amber力場下還是在極化的PPC力場下，通過Nmode計算熵變得到的相關性普遍較低.進一步對結合自由能的計算發(fā)現，凝血酶與小分子的結合主要來自于靜電相互作用和范德華相互作用，其中Leu 96與小分子之間的CH-π和CH-CH相互作用與側鏈的修飾引起的能量變化密切相關，Asp 199與配體之間的形成的兩條穩(wěn)定的氫鍵也提供了很強的靜電相互作用.在結構方面，通過小分子的B-factor，蛋白質的主成分分析以及結合腔體積大小的分析來看，更加復雜的P2或P3側鏈都增強了小分子與蛋白之間的相互作用，并且側鏈中形成的環(huán)狀結構與蛋白質結合的更加穩(wěn)定.這項研究表明，IE方法在預測結合自由能方面優(yōu)于傳統(tǒng)的Nmode方法，強調了靜電極化效應在分子動力學模擬中的重要性，同時揭示了不同結合位點的修飾配體結合自由能變化的原因，為更加有效的凝血酶抑制劑的設計提供了指導[84].

2.5MDMX/MDM2-p53/pDIQ相互作用的研究MDMX(Murine Double Minute X，Hdm4)與MDM2(Murine Double Minute 2，Hdm2)的過度異常表達會導致癌變.p53作為重要的腫瘤抑制因子和轉錄因子，直接參與了細胞的周期調控、代謝、生長、凋亡以及應激過程.MDMX/MDM2的過度表達會使p53的功能喪失，因此研究MDMX/MDM2與p53的相互作用對于治療癌癥是一個非常重要的課題.p53-MDMX/MDM2 相互作用是腫瘤藥物設計的重要靶標，為了平衡MDMX/MDM2的過度表達，Phan等人設計出了與之結合后具有納摩爾級的高結合親和力的肽抑制劑pDIQ[85].pDIQ能抑制和破壞MDMX/MDM2與p53結合，從而維持p53的活性.實驗表明，pDIQ-MDMX/MDM2之間能形成比p53-MDMX/MDM2更強的相互作用，同時MDM2與p53/pDIQ形成的相互作用也比MDMX與p53/pDIQ的強[85-87].

為研究MDMX/MDM2-p53/pDIQ相互作用的機制，采用IE方法對這四個體系進行了系統(tǒng)的研究[88].研究表明：相較于MDMX，p53/pDIQ與MDM2結合能產生更強的結合效果；相較于p53，pDIQ能與MDMX/MDM2結合的更為緊密.對于p53與MDM2結合比MDMX更強的原因在于MD模擬中前者體系比后者有更多的氫鍵形成.另一個原因是p53與MDM2之間的vdW相互作用要強于與MDMX之間.而pDIQ-MDM2體系的相互作用能強于pDIQ-MDMX的主要原因是vdW項的貢獻更強.當與MDMX結合時，p53與pDIQ展現相同的熱點殘基，但是pDIQ的熱點殘基所貢獻的能量總和要高于p53，這是pDIQ比p53能與MDMX結合更強的主要原因.對于MDM2，pDIQ較p53的結合更緊密的原因是pDIQ-MDM2體系中存在著不同于p53-MDM2體系的熱點殘基PHE55、VAL93、ARG65和LYS70，這些可能是導致p53-MDM2和pDIQ-MDM2之間的結合親和力差異的主要因素.p53-MDM2 與pDIQ-MDM2體系的差異殘基相對位置見圖3.這項研究不僅闡明了MDMX/MDM2-p53/pDIQ相互作用的機制，還解釋在實驗中觀察到pDIQ-MDM2結合親和力最強、p53-MDMX最弱，p53-MDM2/pDIQ-MDM2處于中間相互作用機理.它不僅使得研究者能在原子層面上獲知p53與MDMX/MDM2作用機理，還為針對MDMX/MDM2瘤藥物設計的靶標提供了理論支撐.

圖3 MDM2體系關鍵殘基相對位置圖.(a)為p53- MDM2體系；(b)為pDIQ-MDM2；藍色棍棒模型為兩體系間差異殘基.

2.6小結蛋白-配體，蛋白-蛋白是一種由潛在的物理的化學相互作用決定的特定生物識別過程，它幾乎發(fā)生在整個生理過程中.對這些相互作用的研究最直接的實用價值就是促進藥物的研發(fā)，所以關于它們的作用機理研究一直都層出不窮.除本章上文介紹的研究熱門的蛋白質外，研究者對于其它的重要蛋白質的研究也取得一些突破性的進展.Zou等人[89]用IE方法計算了多肽構象熵的貢獻，揭示了O4分子對人胰島淀粉樣多肽(Human Islet Amyloid Polypeptide， hIAPP)詳細破壞機制：無論是hIAPP的五聚體還是十聚體，O4分子都是通過直接與殘基22NFGAI26結合從而破壞了肽間的局部β片層.另外，相互作用熵理論除在研究蛋白-配體的相互作用機制上大放異彩之外，對于藥物的虛擬篩選也能別開蹊徑.2017年Li等人[90]使用相互作用熵從PubChem數據庫中篩選出了AD的兩種潛在藥物：CID 16040294和CID 9998128.一些研究者也對相互作用熵的精確性進行了系統(tǒng)地評估：Biggin課題組對BRDs系列蛋白的復合物和抑制劑為Bromosporine的復合物進行了測試，發(fā)現當使用MM/PBSA計算蛋白-配體的結合自由能時，引入相互作用熵會極大的提高計算精確度，但是幾乎不花費額外的計算成本[11].上述工作都表明了相互作用熵在計算蛋白-配體，蛋白-蛋白的結合自由能時具有相當好的準確性，無論是在計算精確度還是計算成本上都得到很好的改良.相互作用熵的引入不僅使得對蛋白質-配體的相互作用機制有了新的認識[88]，也對蛋白-蛋白間相互作用能的計算提供了創(chuàng)新性的突破[91, 92].但是就總體工作而言，關于蛋白-蛋白相互作用的研究依舊是相對較少，這可能是因為蛋白-蛋白的相互作用的生物功能界面過大導致研究困難.我們也期待著未來對蛋白-蛋白相互作用有著更多的研究工作.

3 結 語

相互作用熵的引入極大提高了MM/PB(GB)SA方法預測生物大分子結合自由能的準確性，同時在計算速度上也實現了很大的提升.目前，相互作用熵方法結合MM/PB(GB)SA方法進行的結合自由能計算已經成功地應用于分子的相互作用機制研究和藥物設計的許多方面.但是隨著應用的增多，研究者也發(fā)現在目前的方法中仍舊存在一些不足之處.

首先是計算速度問題，相互作用熵必須結合MM/PBSA方法才能進行結合自由能的計算.而其中求解PB方程一直以來是一項計算量巨大工作，相較而言，計算相互作用熵的成本幾乎可以被忽略.因此，在計算結合自由能時，所有的計算成本幾乎歸因于焓變的計算上.針對這一缺陷，目前有兩種較為可行方案.

1) 軟加速方法.就是在現有的計算水平上，使用多核CPU并行手段，或者是通過GPU求解PB方程.

2) 使用GB模型來代替PB模型計算極性溶劑化能.事實上，GB模型在計算速度方面的表現在近些年來得到了廣泛的關注，但同時提高GB計算精度也是一項重大的挑戰(zhàn).對此，研究者提出了一系列的GB模型，如GBHCT[93, 94]、GBOBC[95]以及GBGBn[96-98]用以改善GB模型的計算精確度，Hou等人[61]也對這些模型進行了一些測試，在此不再進行贅述.

另一個廣泛關注的問題是計算的準確性問題.結合自由能在計算精度方面的困難一直都是研究者渴望克服的難題.針對這一難題，有如下3個建議.

1) 改善MD模擬.通過三個方面可以進行相對應的調整.其一，調整MD模擬的時間尺度.Wang等人統(tǒng)計自2011年關于MM/PB(GB)SA的應用，總結發(fā)現MD模擬時間嚴重影響的MM/PB(GB)SA所計算的精確度.[99]其二，選擇合適的力場.力場的改進也一直是研究的熱點.AMBER自發(fā)展以來，一直都致力于其力場開發(fā)，且其力場也越來越具有針對性.例如針對蛋白質的protein.ff系列、針對DNA的DNA.bsc1和DNA.OL15、針對RNA的RNA.OL3和RNA.ROC以及針對水分子的water系列.同時也可以采用極化力場進行MD模擬.其三，選擇顯示溶劑模型進行MD模擬.研究表明顯示溶劑水模型的MD模擬對于MM/PB(GB)SA是必不可少的[48].

2) 計算軌跡的選擇.現在主流的計算是采用一條MD模擬軌跡，然后將MD軌跡分成復合物，受體和配體的軌跡用于MM/PB(SA)計算，即1A-MM/PB(GB)SA方法.Samuel等人提出了將復合物、受體以及配體分別進行MD模擬以得到三條互補干擾的軌跡，該方法被稱為為3A-MM/PB(GB)SA.[100]關于這兩種方法的優(yōu)缺點Wang等人[99]已經進行了總結，對此也不再贅述.事實上，計算資源較為充足的情況，對多次1A-MM/PB(GB)SA求平均是一種可信度高的選擇[69, 78, 101-103].

3) 內部參數的調整.可以根據不同的生物分子或者根據不同的殘基類型采用不同的介電常數.該思想在MM/PBSA或者MM/GPBSA方法中都適用.另外，改變PB半徑也可作為一種提高結合自由能精確度的嘗試[104, 105].

相互作用熵方法除在計算結合自由能上有著優(yōu)秀的表現外，將其運用在熱點殘基的預測上也是另辟蹊徑.熱點氨基酸預測中增加了熵變的貢獻極大提高了預測的可信度，另外，相互作用熵的計算速度的優(yōu)勢也依舊被保留了下來.同時，將熱點殘基總能量求和用以計算整個體系的結合自由能，也為研究者計算生物大分子相互作用的結合自由能提供了新的可靠途徑.該理論從提出到現在的四年里，因其理論嚴謹、計算成本低而被廣泛用于研究蛋白-蛋白、蛋白-配體等生物大分子結合自由能計算中.但是關于其在另外一些研究熱門的生物大分子體系上，像DNA-蛋白、RNA-蛋白、凝集素-糖等復合物上鮮有報道，相互作用熵理論也被期待著能在這些體系的研究上取得一些新的進展.