實(shí)時(shí)質(zhì)譜新技術(shù)分析南極磷蝦油的脂質(zhì)組學(xué)輪廓

張燕平 王海星 陳 康 饒 偉 崔益瑋 沈 清*

（1 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省麻醉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 浙江溫州325000 3 沃特世科技（上海）有限公司 上海200120）

南極磷蝦（Euphausia superba）是一類生活在南大洋中的甲殼類浮游動(dòng)物，其具有生物蘊(yùn)藏量大、分布廣等特點(diǎn)，是重要的戰(zhàn)略性海洋新資源。據(jù)估計(jì)，南極磷蝦貯藏量有6.5～10 億t 之巨，最大耐受捕撈量約為400～600 萬t[1]。在世界海洋漁業(yè)資源日益衰減的背景下，日本、挪威等國(guó)家相繼加入南極磷蝦的科研與開發(fā)，并將磷蝦油等相關(guān)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化。南極磷蝦中富含磷脂結(jié)合型n-3脂肪酸，比魚油中的甘油三酯型n-3脂肪酸更易吸收，是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的有效來源[2]。試驗(yàn)表明，南極磷蝦油具有降低膽固醇，預(yù)防老年癡呆癥，預(yù)防動(dòng)脈硬化，抗炎癥，保護(hù)視力及改善大腦學(xué)習(xí)機(jī)能等生理功能[3]。目前針對(duì)南極磷蝦脂質(zhì)組學(xué)研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，開展南極磷蝦脂質(zhì)組學(xué)研究，將深化南極磷蝦脂質(zhì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)以南極磷蝦為原料的蝦油開發(fā)。

脂質(zhì)組學(xué)（Lipidomics）是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后又一迅速發(fā)展的熱門領(lǐng)域，研究?jī)?nèi)容包括生物體內(nèi)脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)鑒定與定量，以及其在生物代謝、疾病、免疫等所扮演的角色分析[4]。隨著軟電離離子化技術(shù)和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及其在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了快速、高精度的分析生物樣品中各種微量脂質(zhì)，極大地促進(jìn)了脂質(zhì)分析規(guī)模性、整體性的發(fā)展[5]。近幾年來質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，研究人員也對(duì)質(zhì)譜高通量快速檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。然而，生物組織樣本無法直接用于高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)，通常需要專業(yè)人員經(jīng)組織均漿、化合物提取、分離純化等復(fù)雜繁瑣的樣品前處理后，方能用于質(zhì)譜分析，無法實(shí)現(xiàn)組織樣本的實(shí)時(shí)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)，亦無法滿足高通量組學(xué)技術(shù)研究的需求[6-8]。

快速蒸發(fā)離子化質(zhì)譜（Rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）是一種用于臨床生物組織原位動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)鑒定的新興技術(shù)手段，以熱電灼蝕生物組織物質(zhì)為基礎(chǔ)，誘導(dǎo)生物分子離子化，形成含有電粒子的氣溶膠，經(jīng)離子傳輸管道進(jìn)入質(zhì)譜儀分析[9]。2009年，Schafer等[10]在解吸電噴霧技術(shù)（Desorption electrospray ionization，DESI）及高頻電刀裝置耦聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上研發(fā)了REIMS，為原位電離質(zhì)譜和質(zhì)譜代謝組學(xué)研究提供了一種全新的研究方法和研究思路。以REIMS 為基礎(chǔ)的組織分析通常只需要幾秒鐘的時(shí)間即可完成數(shù)據(jù)采集與分析并實(shí)現(xiàn)組織識(shí)別，精確度達(dá)到90%～98%。目前，REIMS 已成功應(yīng)用于臨床組織切除，腫瘤診斷，微生物鑒定，食品鑒別等方面。

本研究基于REIMS 建立了高通量實(shí)時(shí)獲取南極磷蝦油脂質(zhì)組學(xué)輪廓的方法，旨在高效、快速分析市場(chǎng)上南極磷蝦油及相關(guān)功能性保健食品的脂類成分，為食品安全相關(guān)職能部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦，遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、異丙醇（均為色譜純級(jí)），德國(guó)Meker 公司；甲酸（色譜純級(jí)），美國(guó)Tedia 公司；亮氨酸腦啡肽，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；其它實(shí)驗(yàn)室常用試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo G2-XS 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有快速蒸發(fā)離子源）、Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)采集軟件、LiveID 統(tǒng)計(jì)分析軟件，美國(guó)Waters 公司；Pump11 elite 針泵注射進(jìn)樣器，美國(guó)Harvard 公司；Milliplus 2150 超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；其它均為實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 南極磷蝦油提取 將南極磷蝦組織勻漿后冷凍干燥，精確稱量5.0 g 樣品于50 mL 離心管中，加入25 mL 95%乙醇振蕩混勻，在恒溫水浴鍋中常溫浸提2 h，混合物用冷凍離心機(jī)以9 000 r/min 條件離心10 min，用移液管轉(zhuǎn)移上清液，向下層沉淀加入15 mL 95%乙醇重復(fù)萃取2 次，合并上清液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于65 ℃下將有機(jī)溶劑蒸干得到南極磷蝦油濃縮液。

1.3.2 質(zhì)譜檢測(cè) 南極磷蝦油樣品通過加熱探頭（500 ℃）離子化，所形成的氣溶膠由文丘里泵氮?dú)猓? bar）驅(qū)動(dòng)，采用正交方式經(jīng)PTFE 管引入質(zhì)譜，主要裝置如圖1所示。以丙二醇/亮氨酸腦啡肽混合物為輔助溶劑，經(jīng)針泵注射進(jìn)樣器以0.1 mL/min 的流量引入端口，用于清洗雜質(zhì)，提高信號(hào)強(qiáng)度，鎖定質(zhì)量校正。質(zhì)譜接口內(nèi)設(shè)鉻鋁鈷耐熱鋼A1 燈絲（1.1 Ω，3 V，500 ℃）用于輔助碰撞電離，離子碰撞后進(jìn)入質(zhì)譜儀StepWaveTM裝置；質(zhì)譜儀掃描時(shí)間：1 s；掃描范圍：m/z 50～1200；所有數(shù)據(jù)均以負(fù)電離模式收集。

圖1 用于檢測(cè)南極磷蝦油脂質(zhì)組學(xué)輪廓的REIMS 裝置圖Fig.1 The setup of REIMS for the acquisition of lipidomics profiling of Antarctic krill oil

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

將原始質(zhì)譜圖經(jīng)MassLynx 進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊及濾噪處理等，結(jié)果保存為文本格式。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到主要質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比，部分主峰碎片離子信息等，結(jié)合Lipid MS Predictor 和LipidMap數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)報(bào)道確定或推測(cè)脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 南極磷蝦油提取優(yōu)化

脂質(zhì)組學(xué)分析常采用的提取方法為Folch 法和Bligh & Dyer 法，然而這2種方法需要用到氯仿等毒性級(jí)別較高的有機(jī)試劑?？紤]到南極磷蝦油作為保健食品的安全性指標(biāo)，本試驗(yàn)采用乙醇作為萃取媒介，從南極磷蝦干粉中提取南極磷蝦油。比較優(yōu)化了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)南極磷蝦油提取率的影響。由圖2可知，南極磷蝦油的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而提高，其中95%乙醇提取效果最佳，當(dāng)使用純乙醇時(shí)，得率有所下降。

2.2 REIMS 脂質(zhì)組學(xué)輪廓分析

REIMS是一種無須任何樣品前處理的實(shí)時(shí)質(zhì)譜方法，通過將原樣表面離子化，獲得實(shí)時(shí)質(zhì)譜輪廓圖。使用LiveID等軟件識(shí)別輪廓圖并對(duì)特征離子峰降維、建模后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品的實(shí)時(shí)鑒定與準(zhǔn)確度評(píng)分。由于REIMS 未與高效液相色譜等分離技術(shù)聯(lián)用，故目前REIMS 相關(guān)研究主要以定性為主，其在化合物精確定量方面尚未有所建樹。因此，本試驗(yàn)研究焦點(diǎn)主要在于獲得南極磷蝦油的脂質(zhì)組學(xué)輪廓圖，對(duì)各個(gè)脂質(zhì)分子的絕對(duì)含量不做具體討論。

REIMS 常用的離子源為單極電極，通過在給定電流下切割組織，使組織表面的小分子快速蒸發(fā)并離子化，通過離子傳輸管路進(jìn)入質(zhì)譜端口。由于南極磷蝦油為液態(tài)樣品，無法使用單極電極切割模式，故本試驗(yàn)采用電熱探頭的方式使南極磷蝦油受熱快速蒸發(fā)，脂類化合物離子化并隨氣溶膠一并進(jìn)入質(zhì)譜質(zhì)量分析器。使用電熱探頭輕觸南極磷蝦油表面，質(zhì)譜掃描范圍設(shè)定在m/z 0～1 200，通過MassLynx 記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)。由圖3可知，南極磷蝦脂質(zhì)分子離子峰主要出現(xiàn)在m/z 200～900 區(qū)域范圍內(nèi)，并由2 個(gè)明顯的峰簇組成，即m/z 200～500 范圍內(nèi)的脂肪酸離子峰簇和m/z 600～900 范圍內(nèi)的磷脂離子峰簇。從相對(duì)含量來看，脂肪酸離子峰的信號(hào)響應(yīng)顯著強(qiáng)于磷脂離子峰的信號(hào)強(qiáng)度，前者的峰面積約為后者的7.6 倍。脂肪酸離子的來源一部分是南極磷蝦油中的游離脂肪酸電離生成，另一部分是甘油酯、磷脂及膽固醇酯等脂類受電熱探頭高能裂解，其脂肪酸鏈碎片化電離后反映在質(zhì)譜圖中。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)南極磷蝦油提取得率的影響Fig.2 The effects of ethanol volume fraction on the extraction yield of Antarctic krill oil

圖3 南極磷蝦油REIMS 全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 The REIMS spectrum of Antarctic krill oil

圖4 南極磷蝦油脂肪酸脂質(zhì)組學(xué)輪廓譜Fig.4 The lipidomics profiling of Antarctic krill oil

圖4a 為南極磷蝦油脂質(zhì)組學(xué)輪廓圖m/z 在200～500 區(qū)域內(nèi)的脂肪酸離子峰，各個(gè)峰分離度較好，信噪比較高幾乎看不到基質(zhì)峰；通過對(duì)其鑒定和積分，得到脂肪酸結(jié)構(gòu)和相對(duì)含量如表1所示。信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度最大的為m/z 301，相對(duì)含量達(dá)到了21.59%，經(jīng)鑒定其結(jié)構(gòu)中碳原子數(shù)和雙鍵比為FA 20：5，即所熟知的EPA。其次分別為m/z 327（FA 22：6，DHA，14.44%），m/z 281（FA 18：1，12.62%），以及m/z 255（FA 16：0，18.74%）。南極磷蝦油中檢出疑似FA 18：4 的脂肪酸離子峰m/z 275（3.78%），該組分通常在植物性油料作物中檢出。同時(shí)，m/z 391，m/z 417等疑似為超長(zhǎng)鏈脂肪酸FA 26：2（6.17%），F(xiàn)A 28：3（2.10%），其存在可能與南極磷蝦受極寒環(huán)境脅迫，促使其代謝產(chǎn)生長(zhǎng)鏈脂肪酸以提高體液流動(dòng)性相關(guān)；相關(guān)假設(shè)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖4b 為m/z 400～900 范圍內(nèi)的磷脂離子峰，由于磷脂的信號(hào)響應(yīng)顯著低于脂肪酸，基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)，經(jīng)降噪和峰提取后，共鑒定出26種磷脂分子，包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂腺肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）。其中信號(hào)最強(qiáng)的離子峰為m/z 763（11.67%），其結(jié)構(gòu)疑似為[PG 36：7-H]－；其次是m/z 737（11.46%），結(jié)構(gòu)[PC O-38：3-choline]－/[PE O-38：3-NH3]－。相同碳原子數(shù)和雙鍵比下，PC 丟失膽堿碎片后的分子結(jié)構(gòu)與PE 脫氨基結(jié)構(gòu)相同，因此在REIMS脂質(zhì)組學(xué)輪廓譜中無法區(qū)分。以質(zhì)譜峰m/z 695.4為例，經(jīng)鑒定其sn1/sn2脂肪酸鏈的總碳原子和雙鏈數(shù)量為34：3，其分子結(jié)構(gòu)組成可能為[PCcholine]-，或[PE-NH3]-，亦或是兩者的重疊。南極磷蝦油中PI 分子較少，僅有m/z 835（[PI 34：1-H]－，1.79%）和m/z 843（[PI O-36：4-H]－，1.47%）檢出。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

有機(jī)溶劑燃點(diǎn)較低，通過電熱探頭離子化易發(fā)生明火，目前尚未構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)定量溶劑體系。因此，方法學(xué)驗(yàn)證中的靈敏度測(cè)試采用倍數(shù)稀釋法，通過向南極磷蝦油中添加預(yù)先脫膠的大豆油稀釋后進(jìn)行REIMS 檢測(cè)。結(jié)果顯示，南極磷蝦油稀釋4倍后26種磷脂分子依然能快速檢出，譜圖經(jīng)降噪后與圖4b 相近，除信號(hào)強(qiáng)度降低以外脂質(zhì)組學(xué)輪廓特征相似，未有顯著差異。南極磷蝦油稀釋10倍后檢出的磷脂分子數(shù)減少為14種，各個(gè)磷脂離子峰的信號(hào)強(qiáng)度等比例下降，部分輪廓特征丟失。精確度測(cè)試采用日內(nèi)精密度和日間精密度評(píng)價(jià)。脂肪酸和磷脂各選取2 個(gè)離子m/z 301，m/z 327，m/z 763 和m/z 737，分別于同一日連續(xù)測(cè)定7 次和連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算得到其日內(nèi)精密度RSD≤6.24%，日間精密度RSD≤8.57%。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法能滿足南極磷蝦油中脂肪酸和磷脂的脂質(zhì)組學(xué)輪廓分析測(cè)試要求。

3 結(jié)論

采用REIMS 技術(shù)將南極磷蝦油中的脂質(zhì)直接離子化并獲得實(shí)時(shí)脂質(zhì)組學(xué)輪廓。在負(fù)離子模式下南極磷蝦油受電熱探頭激發(fā)成離子態(tài)，并隨氣溶膠引入質(zhì)譜端口，經(jīng)質(zhì)量分析器檢測(cè)共有20種脂肪酸和26種磷脂分子被檢出，其中EPA（m/z 301，21.59%）和DHA（m/z 327，14.44%）為質(zhì)譜圖中主要離子峰。該方法能快速、高效進(jìn)行南極磷蝦油脂質(zhì)組學(xué)輪廓實(shí)時(shí)檢測(cè)，相關(guān)數(shù)據(jù)能為質(zhì)譜工作者提供理論基礎(chǔ)，為海洋功能食品企業(yè)和部門提供相關(guān)依據(jù)和參考。

表1 南極磷蝦油中脂肪酸相對(duì)含量與結(jié)構(gòu)分析Table 1 The relative content and probable attribution of fatty acids in Antarctic krill oil

表2 南極磷蝦油中磷脂相對(duì)含量及結(jié)構(gòu)分析Table 2 The relative content and probable attribution of phospholipids in Antarctic krill oil