傳統(tǒng)臭雞蛋腌制中細菌區(qū)系變化及揮發(fā)性風味物質分析

谷新晰 盧海強 申 暢 陳 偉 檀建新

（河北農業(yè)大學食品科技學院 河北保定071001）

“臭”味食品在我國歷史悠久，其濃厚的地域特點和文化特色是我國飲食文化的一個重要分支[1]。我國常見的傳統(tǒng)臭味食物有臭豆腐、臭鱖魚和臭冬瓜[2-4]等，而臭雞蛋鮮有報道。臭雞蛋是以雞蛋為主要原料，以食鹽、大料、花椒等香辛料為配料，經(jīng)多種微生物厭氧腌制而成的一種極具河北地域特色的食品，其產(chǎn)地主要為唐山、滄州、邢臺和石家莊等地區(qū)[5]。臭雞蛋蛋體呈灰白色，有淡淡的臭味，入口后酯香濃郁、余味悠長。目前，臭雞蛋仍以自然腌制為主的家庭生產(chǎn)方式生產(chǎn)，該生產(chǎn)模式雖保留了臭雞蛋的傳統(tǒng)風味，但由于生產(chǎn)、品控等環(huán)節(jié)主要依靠技術人員的經(jīng)驗來判斷，易導致現(xiàn)出產(chǎn)品品質不穩(wěn)定，技術推廣困難等問題，而解決此問題的根本策略是對臭雞蛋腌制中的微生物進行有效控制，這就要以腌制臭雞蛋中細菌區(qū)系規(guī)律變化為理論支撐。到目前為止，臭雞蛋腌制過程中微生物區(qū)系變化規(guī)律、主要微生物及特征揮發(fā)性物質仍不清楚。

微生物區(qū)系研究可采用分離培養(yǎng)技術或分子生物學技術，而由于分離培養(yǎng)技術的局限性，如培養(yǎng)時間長，過程繁瑣及檢測能力低，使得越來越多的科研人員采用分子生物學技術開展微生物區(qū)系變化規(guī)律的研究，如RAPD 技術、16s rRNA 技術、PCR-DGGE 技術和宏基因組技術，這些方法無需進行微生物分離培養(yǎng)，直接對樣品中微生物的宏基因組進行提取、分析，能夠對特殊生態(tài)環(huán)境中的微生物種類及數(shù)量進行定性或定量的研究[6]。當前，雖然宏基因組技術被更多地應用在食品微生物多樣性的研究工作中，然而，由于較低的設備成本、操作便利及結果的可視化，近年來PCR-DGGE技術作為主要工具被用來研究食品中微生物多樣性。如Suchlike等[7]利用PCR-DGGE 技術明確了微生物多樣性與富含微生物食品的產(chǎn)地存在相關性。在我國的白酒、酸菜及腌制肉制品等傳統(tǒng)腌制食品的研究中己有報道，如Lü等[8]同樣利用該技術探討了我國紅曲糯米酒腌制工程中微生物區(qū)系變化規(guī)律，這為我國傳統(tǒng)腌制食品的加工現(xiàn)代化提供了理論支撐。揮發(fā)性風味物質是臭味食品的主要風味物質，對產(chǎn)品整體風味起著重要作用。開展揮發(fā)性風味物質的分析，對于提高產(chǎn)品質量，改進生產(chǎn)工藝具有重要意義。

本研究旨在利用變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE）對傳統(tǒng)腌制臭雞蛋中細菌進行全面系統(tǒng)的分析，揭示不同腌制時期的細菌菌落結構及其動態(tài)演替規(guī)律，明確優(yōu)勢菌群；利用固相萃取結合GC-MS 技術對臭雞蛋進行揮發(fā)性風味物質的分析，旨在確定其特征的風味成分，為臭雞蛋的現(xiàn)代化生產(chǎn)提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 以河北省滄州地區(qū)，農戶自制傳統(tǒng)腌制臭雞蛋鹵水為試驗樣品，于腌制7，14，21，28，60 d 取樣，并分別進行樣品編號為FJ1，F(xiàn)J2，F(xiàn)J3，F(xiàn)J4 和FJ5，貯藏于-20 ℃冰箱，備用。

1.1.2 主要試劑 引物V3F+GC（5'-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3'）和V3R（5'-ATTACC GCGGC TGCTGG-3'），上 海 生工生物工程股份有限公司合成；甲叉雙丙烯酰胺和去離子甲酰胺等試劑，北京博奧拓達科技有限公司；尿素、TEMED、過硫酸銨、硝酸銀，天津市瑞金特化學品有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、PMD19-T Simple Vector 試劑盒、E.coil DH5α Competent Cells，TaKaRa 寶生物（大連）有限公司。

1.1.3 設備與儀器 立式高速低溫離心機，HITACHI 公司；變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)，美國Bio-Rad 伯樂公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠；BINDA 2020D 型凝膠成像系統(tǒng)，北京賓達英創(chuàng)科技有限公司；BiometraPCR 儀，上海愛丁堡生物科技發(fā)展有限公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，Agilent 公司；固相微萃取裝置，Supelco 公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 的提取與純化 利用CTAB 法進行樣品總DNA 的提取，并將總DNA 保存于TE 溶液中，采用天根DNA 純化試劑盒進行純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌 16S rDNA 基因V3 區(qū)的PCR 擴增以提取的不同樣品總DNA 為模板，經(jīng)引物V3F+GC 和V3R 擴增16S rDNA 基因V3 區(qū)。PCR 反應體系：DNA模板50 ng；V3F+GC（10 mmol/μL）1 μL；V3R（10mmol/μL）1 μL；2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL；補ddH2O 至50 μL。PCR 擴增參數(shù)：94 ℃，5 min；94 ℃，30s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR 擴增反應完成后，采用質量濃度為0.02 g/mL 的瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產(chǎn)物的檢測分析。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳 將不同腌制時間樣品的PCR 擴增產(chǎn)物（20 μL）經(jīng)變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)分析，聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為0.1 g/mL，變性梯度為0.3～0.6 g/mL；電泳溫度為60 ℃，70 V 預電泳30 min，110 V 電泳6 h，電泳完畢后，采用銀染法對凝膠進行染色，并進行拍攝。

1.2.4 DGGE 條帶序列分析 對DGGE 膠圖進行分析，標記并切割特異性條帶，其水提液作為模版用不帶“GC 夾”的引物進行PCR 擴增，隨后切膠回收目的基因，將目的基因與pMD18-T Simple Vector 連接，并轉至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，選取陽性克隆，送上海生物工程術有限公司測序，測序結果進行Blast 比對鑒定。根據(jù)測序結果登錄NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對各未知菌株選取標準菌株序列，將各序列用ClustalX2.0 軟件進行比對后，用MEGA7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 細菌多樣性的統(tǒng)計分析 利用Quantity one 軟件測定DGGE 圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度（灰度）測定，對各樣品中細菌多樣性指數(shù)（H）、均勻度（E）和豐富度（S）等指標進行分析；PCA 分析采用CANOCO 軟件進行分析；利用Quantity one 軟件UPGMA 法對不同樣品之間的相似度進行分析。

1.2.6 揮發(fā)性風味物質分析 固相微萃取（SPME）取樣：取1 g 臭雞蛋勻漿液置于15 mL 的鉗口瓶中，在恒溫水浴鍋中40 ℃平衡10 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，于40℃下頂空取樣40 min。

色譜柱：毛細管色譜柱INNOWAX，柱長60 m，內徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm。色譜條件：進樣口溫度250 ℃，SPME 萃取頭解吸3 min ，載氣高純氦氣，流量1.0 mL/min。程序升溫：起始溫度50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 的速度升至80 ℃，以5 ℃/min 的速度升至230 ℃并維持6 min。質譜條件：離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描質量范圍33～450 amu，溶劑延遲3.8 min。各色譜峰的質譜圖結果經(jīng)NIST.14.L 質譜數(shù)據(jù)庫確定各物質組分種類。采用面積歸一化法計算各揮發(fā)性物質的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 腌制臭雞蛋外觀變化

臭雞蛋在腌制的過程中蛋體外觀變化如圖1所示。隨著腌制的進行，蛋白及水分在微生物及食鹽作用下逐步減少，蛋體收縮，臭雞蛋表面由光亮變粗糙并出現(xiàn)褶皺，蛋殼膜和蛋白分離。臭雞蛋內部的蛋黃和蛋白發(fā)生較大變化，腌制7 d，蛋黃和蛋白基本上還保持著未腌制雞蛋的特點；腌制14 d，蛋黃顏色由黃色變?yōu)闇\灰色，蛋白量有所降低；腌制21 d，雞蛋的殼膜和蛋白發(fā)生分離，臭雞蛋表面開始出現(xiàn)褶皺，蛋黃顏色為灰黃色，蛋白量繼續(xù)減少；腌制28 d，雞蛋內部物質流失較大，蛋體明顯變小，蛋黃顏色為灰黃色，質地細膩軟滑。腌制60 d，雞蛋大小較28 d 改變不大，內部蛋黃成深灰色，部分呈糜狀。腌制28 d 的外觀及口感最佳，此結果可作為后續(xù)工藝優(yōu)化的參考。

2.2 基因組16S rDNA V3 區(qū)的PCR 擴增

以提取不同腌制時間臭雞蛋鹵汁樣品的總DNA 為模板，采用V3F+GC 和V3R 引物對DNA模板進行16S rDNA V3 區(qū)的PCR 擴增，取擴增產(chǎn)物3 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)分析PCR 擴增條帶大小約為200 bp，且條帶單一清晰，符合后續(xù)DGGE 分析的要求。

2.3 腌制過程中細菌DGGE 圖譜分析

由圖2可知，在臭雞蛋的腌制過程中16S rDNA 的V3 高變區(qū)序列類型較為豐富，5 條泳道上共出現(xiàn)42 條不同的條帶（圖2a）。圖2b 為DGGE 圖譜示意圖（簡單描述了各條帶的相對強度和分布），一個電泳條帶代表該樣品中不同細菌16S rDNA V3 區(qū)基因片段，即一種微生物。每個樣品均可分離到21 到28 條數(shù)目不等、位置各異的細菌16S rDNA V3 區(qū)片段條帶，條帶數(shù)目最少的為FJ2，21 條，腌制60 d 樣品中微生物種類最為豐富，條帶數(shù)目為28 條。

圖1 臭雞蛋腌制過程中外觀變化Fig.1 Appearance changes of the stinky egg at different fermentation stages

圖2 臭雞蛋腌制過程中的細菌16S rDNA 基因V3 區(qū)DGGE 圖譜分析Fig.2 DGGE profiling of the 16S rDNA gene V3 region from bacterial at the different fermentation stage of stinky egg

臭雞蛋腌制過程中的細菌群落指數(shù)分析見表1。在食鹽和香辛料的影響下，臭雞蛋鹵汁中微生物多樣性（多樣性指數(shù)H）呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。多樣性指數(shù)H 隨著腌制的進行逐步降低，中期階段（8～21 d）降低明顯，隨著微生物的演替，優(yōu)勢菌群逐漸凸顯，在腌制末期（60 d）多樣性指數(shù)H 上升到最高水平2.96。均勻性指數(shù)E 的變化波動較小，同多樣性指數(shù)H的變化趨勢相似呈現(xiàn)初期下降而后上升的趨勢。豐度指數(shù)S 變化趨勢則與多樣性指數(shù)H 基本對應，在樣品FJ5 中最高為28。

表1 臭雞蛋腌制過程中細菌群落結構特征Table 1 Characteristics of bacterial community in different fermentation stage

經(jīng)對微生物菌群在腌制過程的關系進行PCA分析（圖3b）可知，2 個排序軸共同解釋了處理變化的70.5%。FJ1 分布在第2 象限；除樣品FJ2 和FJ3 分布在同一象限外；其它樣品分別分布于其它3 個象限中。圖3a 的帶型進化樹驗證了這個結果，表明在腌制整個過程中，細菌種群的構成變化較大，可以初步將其分為不同的4 個腌制階段，0～7 d 為腌制的早期階段，8～21 d 為腌制的中期階段，22～28 d 為腌制的后期階段，29～60 d 為腌制的末期階段。

圖3 臭雞蛋腌制過程中細菌群落成分分布及主成分分析Fig.3 Distribution and principal component analysis results for the bacterial community of stinky egg

經(jīng)分析在整個臭雞蛋的腌制過程中，微生物細菌區(qū)系結構存在演替變化，這些微生物既有只存在于某個時期的特有微生物，如菌株Band7，Band23，Band38 和Band40，只在腌制的早期階段出現(xiàn)；隨后，Band19，Band27 和Band35 菌株在腌制中期才出現(xiàn)，并直至腌制末期；Band3，Band17，Band20 和Band28 菌株在腌制后期才出現(xiàn)，并直至腌制末期；Band1，Band14，Band29，Band33，Band134 和Band39 菌株在腌制末期才出現(xiàn)；也有在整個過程中始終發(fā)揮作用的微生物，如Band4，Band10，Band12，Band13，Band15，Band18，Band25，Band30，Band37，Band9，Band41 和Band42 參與臭雞蛋腌制的各個階段，而這些微生物在腌制的不同時期也存在差異。

2.4 DGGE 條帶分子鑒定及細菌含量分布

將DGGE 圖譜中各腌制階段都出現(xiàn)的12 個DGGE 條帶進行切膠、回收測序并進行同源比對分析。結果表明，這12種微生物分別來自海桿菌屬（Band4 和Band10）、嗜鹽乳酸菌屬（Band9）、海境勞胞桿菌屬（Band12）、鹽厭氧菌屬（Band13）、鹽乳芽胞桿菌屬（Band15）、鹽單胞菌屬（Band25，Band30，Band37，Band41 和Band42）以及不可培養(yǎng)微生物（Band18），其中，鹽單胞菌屬微生物的種類最多、豐度最高，是臭雞蛋腌制的優(yōu)勢菌屬。

經(jīng)對12種微生物在不同階段相對含量的分析（圖4）可知，不同微生物在4 個腌制階段的相對豐度存在一定的差異，表明這些微生物對不同腌制階段的影響作用不同。海桿菌sp.Band4 隨著腌制的進行，其豐度逐漸變小，相對含量范圍為3.67%～2.14%。嗜鹽乳酸菌sp.Band9 菌株在整個腌制過程中的含量表現(xiàn)出先升后降的現(xiàn)象，在腌制的第2 個時期（8～21d）其相對含量達到最大值，隨后降低，末期含量為0.91%，而相似的變化規(guī)律也在海桿菌sp.Band10、厭氧菌sp.Band13、鹽乳芽胞桿菌sp.Band15、不可培養(yǎng)微生物sp.Band18、鹽單胞菌sp.Band25 和鹽單胞菌sp.Band30 出現(xiàn)，然而它們的相對含量存在較大差異。其中鹽單胞菌sp.Band25 菌株在腌制的4 個階段中的含量為6.7%～19.27%，是臭雞蛋腌制的優(yōu)勢菌。海境勞胞桿菌sp.Band12 在整個腌制過程中總體的變化趨勢也是先上升后下降，但其最高含量出現(xiàn)在腌制的第3 個時期（22～28 d），含量為23.96%，是含量最豐富的一種微生物。

圖4 臭雞蛋不同腌制階段樣品主要細菌含量變化Fig.4 Microbial community during the whole fermentation of stinky egg

2.5 揮發(fā)性風味物質分析結果

臭雞蛋揮發(fā)性風味成分見表2。經(jīng)對腌制28 d 臭雞蛋揮發(fā)風味的分析，共有18種化合物被檢測出，包括6種酸類、2種醛類、4種酯類、3種烷類、2種硫類、1種醇類，它們構成了臭雞蛋的特有風味。

硫類化合物（二甲基二硫和二甲基三硫）含量最高，占總峰值面積的48.7%，是“臭雞蛋”氣味的特征成分；第二大類風味物質為酸類物質（22.2%），其種類最多，共有6種酸類物質被發(fā)現(xiàn)，它們是脂質的水解產(chǎn)物，對臭雞蛋風味起到重要作用，其中的4-甲基戊酸含量最高（7.051%），其次是丁酸；第三大類風味物質為酯類，占總量的11.634%，主要是代謝產(chǎn)物酸類和醇類物質通過酯化反應而來，雖含量較低，對臭雞蛋香氣貢獻較大。

3 討論

我國歷史悠久，傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類眾多，只有少量的一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品從科學理論和實際生產(chǎn)方面進行了探究，如白酒、食醋和酸菜等，而其它眾多傳統(tǒng)發(fā)酵食品如同灑落在我國廣袤土地上的雨滴一樣，不為人所知[9]。臭雞蛋做為河北地區(qū)一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品被當?shù)厝怂矏?，然而同其它傳統(tǒng)發(fā)酵食品一樣，臭雞蛋沒有統(tǒng)一的發(fā)酵周期，同時缺少發(fā)酵終點的判斷，如石家莊和滄州地區(qū)分別在發(fā)酵20 d 和25 d 后即可食用，直至臭雞蛋全部被食用，整個周期大約為2～3 個月左右。上述兩地的臭雞蛋方式帶來的問題主要有2 點：長時間發(fā)酵，臭雞蛋會在腌制的過程中上浮，使得臭雞蛋“變空”；長時間的腌制還會使得臭雞蛋內部的蛋白和蛋黃過度水解，其組織狀態(tài)呈糜爛狀甚至水狀，嚴重影響臭雞蛋的品質。本研究依據(jù)臭雞蛋的品質及微生物區(qū)系變化結果，臭雞蛋的腌制過程可分為腌制早期（0～7 d）、腌制中期（8～21 d）、腌制后期（22～28 d）和腌制末期（29～60 d）。為獲得理想的產(chǎn)品，臭雞蛋應在生產(chǎn)后期終止腌制，這為科學確定臭雞蛋的發(fā)酵周期提供了理論指導。

表2 臭雞蛋揮發(fā)性風味物質的化學鑒定結果Table 2 The identification results of the chemical ingredients of the volatile fragrance of stinky egg

微生物代謝過程中會產(chǎn)生酸、蛋白酶、脂肪酶等產(chǎn)物，能夠將食品中蛋白質、脂肪和糖等大分子物質分解為小分子物質或轉化為其它類物質，不僅有助于消化吸收，同時也釋放出特殊的風味物質，這些產(chǎn)物會在食品發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用[10]，因此探究傳統(tǒng)腌制食品微生物區(qū)系意義重大。共有42種微生物參與了臭雞蛋腌制，而其中的12種主要微生物中2 株來自海桿菌屬，嗜鹽乳酸菌屬、海境勞胞桿菌屬、鹽乳芽胞桿菌屬、鹽乳芽胞桿菌及不可培養(yǎng)微生物各1 株，而來自鹽單胞菌屬微生物數(shù)最多（5 株）。本研究中腌制臭雞蛋中的優(yōu)勢微生物Ban25 為鹽單胞菌屬，該類菌多被發(fā)現(xiàn)于海洋[11]、鹽場[12]及腌制食品等高鹽環(huán)境中。董丹[13]和Jeong等[14]分別從豆瓣醬和海鮮醬中獲得了嗜堿鹽單胞菌，Lee等[15]發(fā)現(xiàn)在腌制蝦中微生物以鹽單胞菌等菌屬為主，其參與腌制有助于脂肪的分解，釋放的脂肪酸有助于形成酸、酮、酯等香味成分，并產(chǎn)生爽滑感[16]，由此推斷，鹽單胞菌菌屬對腌制臭雞蛋的風味產(chǎn)生及蛋黃質地變化起到積極作用。臭雞蛋中的另一個優(yōu)勢菌屬海境勞胞桿菌。2002年，首次由Ishikawa等[17]發(fā)現(xiàn)，其生理特點適合在腌制臭雞蛋的環(huán)境中生長，本文首次在腌制食品中發(fā)現(xiàn)了該類菌，而其在腌制過程中所發(fā)揮的作用還需進一步研究。

揮發(fā)性風味物質是臭味食品的主要風味物質，對產(chǎn)品整體風味起著重要作用，開展揮發(fā)性風味物質的測定對于提高產(chǎn)品質量，改進生產(chǎn)工藝具有重要意義。臭雞蛋的揮發(fā)性物質的結構性質分為6 大類，包括6種酸類、2種醛類、4種酯類、3種烷類、2種硫類、1種醇類，它們構成了臭雞蛋的特有風味。本研究中發(fā)現(xiàn)二甲基二硫和二甲基三硫是臭雞蛋中的最主要的揮發(fā)性物質，這與臭豆腐揮發(fā)性風味物質相一致[18]，而兩者在其它揮發(fā)性風味物質的種類存在差異，除了原料造成的差異外，兩者的微生物區(qū)系是造成風味差異的另一個主要原因[19]。

本研究首次對臭雞蛋樣品細菌區(qū)系變化規(guī)律及其揮發(fā)風味物質進行了研究，明確鹽單胞菌屬和海境勞胞桿菌屬微生物為臭雞蛋腌制的優(yōu)勢菌屬；含有6類特征揮發(fā)性風味物質，這為臭雞蛋腌制的現(xiàn)代化生產(chǎn)提供了一定的理論指導。