可視化跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)檢測食品中沙門氏菌

張?zhí)N哲 苑 寧 李靳影 張夢澤 馬曉燕 張 偉，，3*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院 河北滄州061100 3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定071001）

沙門氏菌是腸桿菌科中重要的食源性致病菌之一，能夠引起多種沙門氏菌病，例如腹瀉、嘔吐、腹部絞痛、肺炎甚至菌血癥等[1-2]，在食物中不允許檢出。食源性沙門氏菌病已成為全球公眾健康的嚴重威脅。在美國，每年有120 萬人感染沙門氏菌，2016年沙門氏菌感染的發(fā)病率為15.4/10 萬[3]。在歐盟地區(qū)，每年有超過16 萬人感染沙門氏菌[4]。沙門氏菌的傳統(tǒng)檢測方法大約需要5d 才能獲得陽性結(jié)果，該方法耗時，耗力，靈敏度低，無法滿足快速檢測的需求[5]。建立一種簡便、快捷的方法對于食品中沙門氏菌的檢測尤為重要。

本研究建立了1種新型的核酸體外等溫擴增方法-可視化跨越式滾環(huán)等溫擴增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）方法[6]。該方法僅需要1 對引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下即可進行核酸體外等溫擴增?？赏ㄟ^肉眼直接觀察熒光現(xiàn)象，實現(xiàn)結(jié)果判別可視化。與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[7]相比，SRCA 引物數(shù)量減少，設(shè)計更加簡便，反應(yīng)體系簡單，檢測成本降低了約50%，并且可通過對反應(yīng)產(chǎn)物測序來證實擴增結(jié)果的準確性，而LAMP 則不能對擴增產(chǎn)物測序。與滾環(huán)擴增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）[8]相比，SRCA 無需鎖式探針和連接酶環(huán)化，操作步驟簡單，反應(yīng)過程縮短約3 h，檢測成本亦大大降低。

SRCA 方法擴增原理[9]如圖1所示。首先，正向引物（Forward primer，F(xiàn)WP）與靶單鏈DNA（Single strand DNA，ssDNA）中的互補序列結(jié)合，進行鏈的延伸（步驟5）。當(dāng)延伸至5' 末端即非閉合環(huán)狀交叉位點時，在Bst DNA 聚合酶的作用下通過添加堿基跨過這個交叉位點，并繼續(xù)延伸（步驟6）。Bst DNA 聚合酶有不依賴模板而獨立進行鏈的延伸的能力[10]。當(dāng)延伸至之前的正向引物結(jié)合位點處，先前的DNA 鏈被替換下來，并繼續(xù)延伸（步驟7）。隨著鏈的延伸，反向引物（Reverse primer，RVP）結(jié)合位點暴露出來。RVP 隨后結(jié)合到新生成的ssDNA 的相應(yīng)結(jié)合位點（步驟8）。隨著鏈的延伸，之前的擴增產(chǎn)物被不斷置換下來（步驟9）。同時，F(xiàn)WP 與相應(yīng)的互補區(qū)域結(jié)合并進行鏈的延伸，由此產(chǎn)生許多串聯(lián)重復(fù)的線性雙鏈DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）（步驟10，11）。

圖1 SRCA 反應(yīng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of SRCA assay

本研究以stn 基因為靶基因，利用SRCA 擴增原理建立可視化跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)檢測沙門氏菌的方法，并評估此方法的檢出率、敏感性、特異性和符合率，為食品中致病菌的快速檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 本研究所用菌株如表1所示。

1.1.2 儀器與設(shè)備 DL-CJ.IN 超凈無菌工作臺，哈爾濱市東連公司；PCR 儀，德國Biometra 公司（Biometia Co.，Ltd）；超凈無菌工作臺，蘇州雙天公司；DXY- 33A 型電泳儀，北京市六一儀器廠；DH-6000-AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器設(shè)備有限公司；UVIPro 凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec 華粵企業(yè)有限公司；NanoDrop 2000 分光光度計，北京研興廣發(fā)公司；勝啟恒溫水浴鍋，南通海之星有限公司。

1.1.3 試驗試劑 本研究所用培養(yǎng)基均來自北京路橋技術(shù)有限公司；Taq 酶、dNTPs、MgSO4、100 bp DNA Marker、Cla I 限制性核酸內(nèi)切酶、Bst DNA聚合酶（8 U）、SYBR Green I 熒光染料，大連寶生物有限公司。膠回收試劑盒、DNA 提取試劑盒，北京華大生物有限公司。SRCA 引物合成于北京華大基因。

1.1.4 引物設(shè)計 本研究選取stn 基因為沙門氏菌的靶基因，根據(jù)GenBank 中公布的stn 基因序列進行BLAST 同源性分析，使用DNAMAMN 設(shè)計引物，并由北京華大基因合成，具體引物序列如表2所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)與DNA 提取 將保存的細菌接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上活化，于37 ℃下過夜培養(yǎng)。挑取活化好的菌落接種于新鮮的營養(yǎng)肉湯中，37 ℃條件下過夜培養(yǎng)，備用。

本研究采用試劑盒法提取表1 中所有菌株的基因組DNA。

1.2.2 SRCA 和PCR 反應(yīng)體系 經(jīng)過優(yōu)化，建立了最佳的SRCA 擴增體系：模板DNA 1.0 μL（陰性對照不添加模板），上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L each），10×Bst DNA reaction buffer 2 μL，1 μL MgSO4（25 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8 000 U/mL），最終總反應(yīng)體系為20 μL。于62 ℃反應(yīng)90 min，并于80 ℃保持5 min 終止反應(yīng)。

本研究采用PCR 方法評估SRCA 的靈敏度和檢出限。其反應(yīng)體系（25 μL）如下：上下游引物各1 μL（與SRCA 上下游引物相同），dNTPs 4 μL，Buffer 1.5 μL，MgSO40.5 μL，1 μL Taq 聚合酶（5 U/μL），模板DNA 1 μL（陰性對照不添加模板），去離子水補足體系至25 μL。

1.2.3 SRCA 產(chǎn)物可視化分析 向SRCA 擴增產(chǎn)物中加入1 μL 熒光染料SYBR Green I，肉眼觀察顏色變化。陽性結(jié)果為綠色，陰性結(jié)果顯示為橙色。

1.2.4 SRCA 擴增產(chǎn)物測序分析和酶切分析 選取清晰的SRCA 擴增產(chǎn)物的條帶（從下往上共切取3 條）回收，純化后測序。

采用限制性內(nèi)切酶Cla I 對產(chǎn)物酶切驗證，于60 ℃條件下反應(yīng)3 h，通過凝膠電泳法觀察酶切產(chǎn)物。

1.2.5 SRCA 引物特異性分析 選取13 株沙門氏菌標準菌株和14 株非沙門氏菌菌株進行特異性分析，并通過熒光可視法驗證產(chǎn)物。

1.2.6 SRCA 靈敏度分析 為確定SRCA 檢測沙門氏菌DNA 的靈敏度，使用NanoDrop 2000 分光光度計測定提取的基因組DNA 濃度，并用無菌去離子水10 倍梯度稀釋。SRCA 產(chǎn)物通過熒光可視法分析，確定SRCA 反應(yīng)的靈敏度。

以PCR 檢測方法為對照，評估SRCA 方法的靈敏度。依照1.2.2 節(jié)中的PCR 反應(yīng)體系進行反應(yīng)，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定PCR反應(yīng)的靈敏度，進而評估SRCA 法的靈敏度。

1.2.7 人工污染雞肉中沙門氏菌SRCA 檢出限分析 取25 g 通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法確定不含沙門氏菌的雞肉樣品加入到225 mL 無菌生理鹽水中（該操作在無菌環(huán)境下進行）均質(zhì)，取1 mL 過夜培養(yǎng)的沙門氏菌菌液加入上述9 mL 均質(zhì)液中制成菌懸液，采用滅菌的生理鹽水10 倍梯度稀釋。通過平板計數(shù)法確定活菌數(shù)為3.8×100～3.8×108CFU/g。取每個稀釋度菌懸液1 mL，采用試劑盒法提取基因組DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。SRCA 產(chǎn)物通過熒光可視法分析，確定SRCA 方法的檢出限。

以PCR 檢測方法為對照，評估SRCA 方法的檢出限。將上述提取的基因組DNA 進行PCR 反應(yīng)，擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳法進行分析，確定PCR方法的檢出限，進而評估SRCA 法的檢出限。

1.2.8 SRCA 的實際應(yīng)用與評估 為了驗證SRCA 方法對實際樣品中沙門氏菌的檢出情況，在保定某農(nóng)貿(mào)市場隨機購買30種實際樣品，包括18種熟食、3種生肉、5種蛋和蛋制品、4種奶和奶制品，并通過SRCA 方法和GB 4789.4-2016[11]2種方法檢測30種樣品中沙門氏菌的污染情況。

采用敏感性（Sensitivity）、特異性（Specificity）及符合率（Accuracy）3 個指標評價SRCA 方法。計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 SRCA 擴增產(chǎn)物的可視化

SRCA 反應(yīng)結(jié)束后，向SRCA 反應(yīng)管中加入1 μL 的熒光染料SYBR Green I，由圖2可知，陽性反應(yīng)管（2）的顏色由橙色變?yōu)榫G色，而陰性對照管（1）仍為橙色。

2.2 SRCA 擴增產(chǎn)物測序和酶切結(jié)果分析

圖2 跨越式滾環(huán)等溫擴增SRCA可視化結(jié)果Fig.2 The visualization results of the SRCA products

由圖3b可知，SRCA 擴增產(chǎn)物經(jīng)過Cla I 限制性內(nèi)切酶酶切消化后，其酶切片段為200 bp 左右，與理論計算值一致。為了進一步驗證SRCA產(chǎn)物，對圖3a 中的擴增產(chǎn)物電泳條帶（D1，D2，D3）進行測序分析。測序結(jié)果（圖3c）顯示靶片段與用于引物設(shè)計的stn 基因的同源性達到100%，并且產(chǎn)物是含有多個串聯(lián)重復(fù)單元的靶序列。表明，SRCA 擴增反應(yīng)符合SRCA 原理，擴增結(jié)果正確。

2.3 SRCA 特異性分析

對27 株菌株進行特異性分析，檢測結(jié)果如圖4所示。其中，13 株沙門氏菌發(fā)生了SRCA 反應(yīng)，而其它14 株非沙門氏菌均未發(fā)生SRCA 反應(yīng)，說明SRCA 引物具有良好的特異性。

圖4 SRCA 反應(yīng)的特異性檢測結(jié)果Fig.4 The specificity test by SRCA

2.4 SRCA 靈敏度分析

經(jīng)NanoDrop 2000 分光光度計測定，提取的沙門氏菌的DNA 質(zhì)量濃度為5.6×107fg/μL。對上述模板進行10 倍梯度稀釋，并進行SRCA 反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)管中分別加入1 μL SYBR Green I 熒光染料。當(dāng)模板質(zhì)量濃度為5.6×107～5.6×100fg/μL 時，反應(yīng)管中的顏色呈綠色，當(dāng)模板質(zhì)量濃度為5.6×10-1fg/μL 時，反應(yīng)管中的顏色仍為橙色。因此，SRCA 熒光可視法檢測沙門氏菌DNA 的靈敏度為5.6×100fg/μL。

采用上述稀釋模板進行PCR 反應(yīng)，試驗結(jié)果如圖5b所示，當(dāng)DNA 質(zhì)量濃度為5.6×107～5.6×102fg/μL 時，有目的條帶。當(dāng)DNA 質(zhì)量濃度為5.6×101～5.6×10-1fg/μL 時沒有目的條帶，因此，PCR 法的靈敏度為5.6×102fg/μL。

由此可知，SRCA 法檢測的靈敏度為PCR 法的100 倍。

2.5 人工污染雞肉中沙門氏菌的SRCA 檢出限分析

由圖6a可知，當(dāng)人工污染雞肉樣品的活菌數(shù)為3.8×107～3.8×101CFU/g 時，反應(yīng)管中的顏色呈綠色。當(dāng)人工污染雞肉樣品的活菌數(shù)為3.8×100CFU/g 時，反應(yīng)管中的顏色依然為橙色。因此，人工污染雞肉中沙門氏菌的SRCA 檢出限為3.8×101CFU/g。

對人工污染雞肉樣品進行PCR 檢測，結(jié)果由圖6b所示，當(dāng)人工污染雞肉樣品的活菌數(shù)為3.8×107～3.8×103CFU/g 時，有明顯的目的條帶生成。然而，當(dāng)活菌數(shù)再降低時，沒有出現(xiàn)目的條帶。因此，人工污染雞肉樣品的PCR 法檢出限為3.8×103CFU/g。

由此可知，SRCA 方法的檢出限為PCR 方法檢出限的100 倍。

圖5 靈敏度分析Fig.5 The analysis of sensitivity

圖6 檢出限分析Fig.6 The analysis of detection limit

2.6 實際樣品的檢測與SRCA 方法的評估

利用GB 4789.4-2016[11]和SRCA 2種方法檢測30種食品。結(jié)果如表3所示。

表3 SRCA 方法評價Table 3 Evaluation of SRCA method

3 結(jié)論

1）本研究建立了SRCA 快速檢測食品中沙門氏菌的方法，并通過肉眼觀察熒光顏色判斷結(jié)果，方便簡單。

2）采用SRCA 對13 株沙門氏菌和14 株非沙門氏菌進行特異性檢測，其中13 株沙門氏菌顯示為陽性，其它均顯示陰性結(jié)果，說明本研究設(shè)計的引物具有較好的特異性。

3）SRCA 技術(shù)檢測沙門氏菌DNA 的靈敏度為5.6×100fg/μL，人工污染雞肉樣品中的沙門氏菌檢出限為3.8×101CFU/g，均是傳統(tǒng)PCR 方法的100 倍，因此SRCA 技術(shù)具有更高的靈敏度和更低的檢出限。

4）使用GB 4789.4-2016 法[11]和SRCA 法對30種實際樣品進行沙門氏菌的檢測，并以GB 4789.4-2016 法為標準對SRCA 法進行評估，其敏感性為100%，特異性為96.30%，符合率為96.67%。

SRCA 方法具有操作簡便，體系簡單，特異性強，靈敏度高，檢出限低的優(yōu)點，因此，適合基層單位推廣應(yīng)用。