嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-MS指紋圖譜

任為一 陳海燕 李 婷 田佳樂 丹 彤 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室呼和浩特010018）

嗜熱鏈球菌一般“被認為是安全”的菌種，常作為發(fā)酵劑菌種廣泛應用于乳制品行業(yè)[1-4]。嗜熱鏈球菌在乳制品制作過程中，能快速產(chǎn)酸，代謝乳糖，生成胞外多糖，產(chǎn)維生素及風味物質(zhì)。這些風味物質(zhì)的種類繁多，其中，酸類、醛類、酮類、醇類和酯類等化合物對發(fā)酵乳的風味影響較大[5-8]。目前，從發(fā)酵乳中檢測到多種揮發(fā)性化合物，然而，一些學者認為只有少數(shù)的揮發(fā)性風味物質(zhì)對乳制品的風味產(chǎn)生影響。乳制品中風味化合物的實際貢獻取決于嗅感物質(zhì)的絕對濃度和感覺閾值[9]，常用氣味活性值（OAV，嗅感物質(zhì)的絕對濃度和感覺閾值）闡明樣品中揮發(fā)性化合物對總體風味的貢獻程度[10-11]。OAV 值大于或等于1，認為該化合物對其香氣有作用，且OAV 值越大，對整體香氣的貢獻度就越大。

酸奶是消費者非常喜愛的一類發(fā)酵乳制品。目前對乳酸菌在發(fā)酵乳制作和貯藏期間產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的研究報道很少。本試驗選用的嗜熱鏈球菌IMAU80285是由傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品曲拉中分離出來的一株具有良好風味的菌株[12]。為了解該菌株發(fā)酵乳制作及貯藏期間不同階段的風味物質(zhì)組成、含量差異與變化情況，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）技術(shù)富集、分析發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味物質(zhì)，同時結(jié)合OAV 值鑒定其中的關(guān)鍵風味物質(zhì)，闡明發(fā)酵乳中風味物質(zhì)的動態(tài)變化規(guī)律，為今后研制具有良好風味和穩(wěn)定發(fā)酵性能的高品質(zhì)發(fā)酵劑提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用的嗜熱鏈球菌IMAU80285 分離自四川省阿壩州紅原縣瓦切鄉(xiāng)二隊的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品曲拉中，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供。試驗所用的脫脂乳粉和全脂乳粉由美國Fonterra 公司生產(chǎn)，MRS 培養(yǎng)基購自英國OXOID 公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890B GC system-5977A MSDq 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱（HP-5 毛細管柱, 30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國Agilent 公司；手動固相微萃取(SPME)進樣手柄、固定搭載裝置及50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）、萃取頭、陶瓷加熱磁力攪拌器，美國SUP-ELCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備 將在-4 ℃冷凍干燥保藏的嗜熱鏈球菌IMAU80285 菌株于脫脂乳培養(yǎng)基（10%脫脂乳，0.1%酵母粉）中活化，隨后接種于MRS 液體培養(yǎng)基中傳3 代，使菌株活力達到最大。將菌株于50 mL 和500 mL MRS 液體培養(yǎng)基中連續(xù)擴大培養(yǎng)，離心收集菌體并制備菌懸液。將該菌株的菌懸液以5×107CFU/mL 的接種量接種于均質(zhì)后的全脂乳中，并分裝于樣品瓶中。將樣品置于42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并在發(fā)酵4 h 和發(fā)酵6 h 時取樣，待樣品達到發(fā)酵終點（即pH=4.5）時，將樣品轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱貯藏，并分別于前發(fā)酵、后熟及貯藏期1，2，3，7，14 d 取樣，隨后進行SPME-GC-MS檢測分析。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

1）色譜條件 載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣，進樣口溫度250 ℃。程序升溫方式：起始溫度為35 ℃，保持5 min 后以5 ℃/min 的速率上升至140 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 的速率上升至250 ℃，保持3 min；

2）質(zhì)譜條件 全掃描模式；EI 離子源；電子能量70 eV；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500 U；無溶劑延遲。

3）SPME 萃取條件 50 ℃平衡60 min；

4）解吸附條件 250 ℃條件下解吸附3 min。

1.3.3 定性與定量分析

1）定性方法 利用隨機攜帶Masshunter 工作站NIST 11 標準庫進行自動比對，挑選匹配率≥85%的物質(zhì)作為鑒定結(jié)果，同時依據(jù)VANDENDOOL[13]的方法測定保留指數(shù)（Retention indices，RI），再根據(jù)文獻報道的RI 值對發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行再次鑒定。

2）定量方法。在發(fā)酵樣品中加入內(nèi)標物1，2-二氯苯溶液，樣品中各組分風味物質(zhì)的質(zhì)量濃度可代入公式（1）計算：

式中：ci——待測樣品中各風味化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；cs——1，2-二氯苯的質(zhì)量濃度，μg/L；Ai——樣品中待測物質(zhì)對應的色譜峰面積；As——內(nèi)標物色譜峰面積。

1.3.4 香氣活度值評價法 在對發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物定量的基礎上，以各風味化合物在水中的風味閾值作為參考，計算能表征風味化合物貢獻率的物理量——香氣活度值（Odor activity value，OAV）。可代入公式（2）計算：

式中：OAVi——風味化合物i 的香氣活度值；Ci——發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；OTi——所測風味化合物在水中的氣味閾值。

1.3.5 GC 指紋圖譜相似度計算 采用夾角余弦法分析發(fā)酵乳樣品GC 指紋圖譜間的相似性，該算法能夠反映和識別風味復雜成分在化學組成與含量比例上的相似性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、SIMCA-P 進行數(shù)據(jù)處理及主成分分析，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版，來計算和評價發(fā)酵乳樣品的GC 指紋圖譜相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 結(jié)果分析

嗜熱鏈球菌IMAU80285 在發(fā)酵乳制作及貯藏過程中共檢測到84種揮發(fā)性風味物質(zhì)（表1），經(jīng)NIST 11 標準庫檢索各組分揮發(fā)性成分，主要包括酸類化合物、醛類化合物、酮類化合物、醇類化合物、酯類化合物、烷烴類及含氮化合物化合物；結(jié)合表1所示物質(zhì)的含量和感覺閾值，確定各組分的OAV，如表2。

表1 嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性風味物質(zhì)的SPME-GC-MS 鑒定結(jié)果Table 1 Volatile compounds produced from milk fermented by S.thermophiles by SPME-GC-MS

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

表2 嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中關(guān)鍵性風味物質(zhì)及對應OAV 值Table 2 OAVs for different compounds produced by milk fermented by S.thermophilus

（續(xù)表2）

在發(fā)酵乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類化合物主要來源于脂肪分解、蛋白質(zhì)水解等代謝途徑[14]。一般認為癸酸、乙酸、己酸和辛酸等線性鏈酸由脂肪分解產(chǎn)生，而3-甲基丁酸等支鏈酸由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生[14]；在發(fā)酵和貯藏期間嗜熱鏈球菌IMAU80285發(fā)酵乳中共檢測到11種酸類化合物，其中，癸酸在發(fā)酵及貯藏期間均被檢出，特別是在發(fā)酵前期達到峰值，為1.33 μg/L。此外，含量較高的化合物有3-甲基丁酸、乙酸、己酸和辛酸，其中3-甲基丁酸僅在發(fā)酵4，6 h 及發(fā)酵終點被檢出。乙酸的質(zhì)量濃度呈上升趨勢，在貯藏14 d 時達到13.67 μg/L；己酸和辛酸都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，己酸在貯藏1 d 時含量達到最高，辛酸在發(fā)酵終點達到7.88 μg/L；酸類化合物不僅是芳香化合物，還是甲基酮、醇類、酯類和醛類等化合物的前體物質(zhì)[15]。由于酸類化合物閾值較高，對發(fā)酵乳的風味影響較小。

在發(fā)酵及貯藏期間共檢測到13種醛類化合物，醛類物質(zhì)在發(fā)酵4 h 和6 h 時較其它時間點含量高。發(fā)酵乳中檢出的醛類關(guān)鍵性風味物質(zhì)（OAV≥1）有3-甲基丁醛、辛醛、己醛、庚醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-己烯醛、（E）-2-戊烯醛、（E）-2-癸烯醛。醛類化合物化學性質(zhì)比較活潑，多為中間體化合物，一般不能穩(wěn)定存在，在后熟階段容易被還原成相應的酸類化合物和醇類化合物[16]，如3-甲基丁醛、己醛等。庚醛、辛醛和壬醛等主要由油酸氧化生成的[17]，庚醛在發(fā)酵期間含量較高，在發(fā)酵6 h 時達到3.05 μg/L；己醛是亞油酸的一級氧化產(chǎn)物[17]，在發(fā)酵4 h 時質(zhì)量濃度達到峰值，隨后呈下降趨勢。（E）-2-庚烯醛等烯醛類化合物主要是以亞油酸為前體物質(zhì)經(jīng)脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝生成[17]；（E）-己烯醛在發(fā)酵及貯藏過程中均被檢出，且呈現(xiàn)上升的趨勢，在貯藏14 d 時達到峰值（1.78 μg/L）；苯甲醛是由苯丙氨酸的Strecker 降解反應生成的[18]，僅在發(fā)酵4 h 時沒有檢出苯甲醛。

在發(fā)酵乳制作和貯藏期間產(chǎn)生的酮類物質(zhì)總含量遠高于其它幾類物質(zhì)，且在前發(fā)酵、后熟及貯藏1 d 時含量最高。甲基異丁基甲酮僅在貯藏期間被檢測到，其質(zhì)量濃度變化范圍在32.25～37.79 μg/L；乙偶姻是發(fā)酵乳中普遍存在的一種對風味有重要影響的酮類化合物，它主要由2，3-丁二酮降解和α-乙酰乳酸經(jīng)脫羧生成[19]。乙偶姻在發(fā)酵初期呈現(xiàn)增加趨勢，隨后開始下降，類似的研究結(jié)果在Delgado等[20]的報道中也有發(fā)現(xiàn)；發(fā)酵乳中檢出的酮類關(guān)鍵性風味物質(zhì)（OAV≥1）有2，3-丁二酮、3-甲基-2-丁酮、2-壬酮；2，3-丁二酮是甲基酮通過α-氧化脂肪酸而形成[21]，在前發(fā)酵時質(zhì)量濃度達到14.98 μg/L，隨后略有降低；3-甲基-2-丁酮在貯藏1 d 時含量增加到23.59 μg/L；2-壬酮是由辛酸的β-氧化和癸酸的脫羧反應生成[22]，在發(fā)酵和貯藏期間其濃度逐漸降低，在貯藏14 d 時降至1.68 μg/L。

發(fā)酵乳中的醇類化合物可能與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解等有關(guān)[23]，醇類化合物是該菌株發(fā)酵乳中檢出種類最多的化合物，其中正已醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇含量較高，且在發(fā)酵及貯藏期間均被檢測到。醇類化合物閾值較高，一般認為這類化合物對發(fā)酵乳的風味貢獻率較低。本試驗中檢出的關(guān)鍵性風味物質(zhì)（OAV≥1）僅有2種，分別為1-辛烯-3-醇、2-異丙基-5-甲基-1-庚醇。1-辛烯-3-醇是12-脂氧合酶對花生四烯酸作用的產(chǎn)物[24]。在發(fā)酵開始時其質(zhì)量濃度較高，達到5.68 μg/L，隨后開始下降。3-甲基丁醇、（E）-2-辛烯-醇、1-壬醇等3種化合物對發(fā)酵乳的總體香氣具有修飾作用。3-甲基丁醇是3-甲基丁醛的代謝產(chǎn)物，在貯藏期間其質(zhì)量濃度略有增加，在貯藏2 d 時達到峰值。

發(fā)酵乳中的酯類物質(zhì)大多是分子質(zhì)量較小的酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應或環(huán)化反應生成的低級脂肪酸化酯[25]。本試驗中檢測出9種酯類化合物，其中關(guān)鍵性風味物質(zhì)（OAV≥1）僅有1種，為甲酸乙烯酯，起重要修飾性作用的風味物質(zhì)（0.1≤ROAV<1）有2種，分別為丁酸乙酯、己酸乙酯。甲酸乙烯酯在發(fā)酵、前發(fā)酵、后熟和貯藏前期（1，2 d）被檢出，在貯藏2 d 時達到峰值，為31.15 μg/L。發(fā)酵乳中的乙酯類化合物帶來的水果香味可以降低高濃度的酸產(chǎn)生的酸敗味道[26]。本試驗中低水平的丁酸乙酯和己酸乙酯被檢出，但由于較低的閾值，對發(fā)酵乳的整體風味貢獻較大。類似的研究結(jié)果在Delgado等[27]的報道中也有發(fā)現(xiàn)。

烷烴類化合物和含氮化合物有比較高的風味閾值，一般認為對發(fā)酵乳風味的作用不大，但一定濃度的這些化合物可以使發(fā)酵乳的口感更加飽滿[28]。

2.2 發(fā)酵乳中風味物質(zhì)的主成分分析

由表2可知，發(fā)酵乳在發(fā)酵及貯藏期間共有16種風味物質(zhì)的OAV 值不小于1，共有32種風味物質(zhì)的OAV 值不小于0.1。發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類豐富，可以集中研究對發(fā)酵乳風味有貢獻（OAV＞0.1）的風味物質(zhì)。

結(jié)合表2 中揮發(fā)性風味物質(zhì)的OAV 值，對發(fā)酵及貯藏各階段的揮發(fā)性風味物質(zhì)（OAV≥0.1）進行主成分分析，時間點與香氣成分在主成分載荷圖上越接近，兩者的相關(guān)性越高。由發(fā)酵過程及貯藏期間發(fā)酵乳樣品主成分得分圖（圖1）可知，得分圖被分成左右兩個區(qū)域，右半?yún)^(qū)對應發(fā)酵初期（即發(fā)酵4，6 h）和前發(fā)酵，左半?yún)^(qū)對應貯藏期間（后熟，貯藏1，2，3，7，14 d）。由圖1（發(fā)酵過程及貯藏期間發(fā)酵乳樣品主成分得分圖）和圖2（風味物質(zhì)載荷圖）可知，發(fā)酵初期（發(fā)酵4，6 h）和前發(fā)酵時發(fā)酵乳的風味與辛醛、庚醛、壬醛、己醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-2-戊烯醛、（E）- 2-辛烯醛、（E）-2-癸烯醛、2-壬酮、2-庚酮、3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-異丙基-5-甲基-1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、己酸乙酯、甲酸乙烯酯等17種OAV≥0.1的風味物質(zhì)有較強的相關(guān)性，庚醛能賦予發(fā)酵乳迷人的脂肪香味[29]，辛醛、壬醛和低濃度的己醛能賦予食品一定的青香、果香香味[17]，3-甲基丁醛具有巧克力、青草的香味[30]，2-壬酮能夠賦予發(fā)酵乳奶香味[22]，1-壬醇具有玫瑰和橙的香氣[31]，乙偶姻具有弱奶油香味[19]，己酸乙酯具有類似蘋果、香蕉的香氣[32]。貯藏期間（后熟，貯藏1，2，3，7，14 d）發(fā)酵乳風味與2，3-丁二酮、（E）- 2-辛烯-1-醇、（E）-己烯醛、苯甲醛、3-甲基-1-丁醇、丁酸乙酯、乙基苯等7種OAV≥0.1 的風味物質(zhì)有較強的相關(guān)性，2，3-丁二酮能夠賦予發(fā)酵乳奶油香味[33]，（E）-己烯醛等烯醛類化合物具有類似橘子皮的香味[34]，苯甲醛能賦予產(chǎn)品杏仁香、堅果香和水果香[18]，2-庚酮能夠賦予發(fā)酵乳水果味[25]，丁酸乙酯具有強烈的果香香氣，香蕉和菠蘿香味[35]。

圖1 發(fā)酵過程及貯藏期間發(fā)酵乳樣品主成分得分圖Fig.1 Score scatter plot of fermented milk in the period of fermentation and storage

圖2 風味物質(zhì)載荷圖Fig.2 Loading scatter plot of volatile components

2.3 指紋圖譜分析

指紋圖譜能體現(xiàn)中藥成分的復雜性和相關(guān)性，是國際公認的控制中藥材質(zhì)量的有效手段[36]。發(fā)酵乳是一個類似中藥的復雜體系，應用指紋圖譜技術(shù)可以全面反映發(fā)酵乳中風味化合物的種類和數(shù)量，評價發(fā)酵乳的品質(zhì)。本試驗通過對嗜熱鏈球菌IMAU80285 在發(fā)酵乳制作和貯藏期間產(chǎn)生的揮發(fā)性風味化合物的色譜分析，建立了不同發(fā)酵時間乳樣品的重疊色譜圖（圖3），同時采用夾角余弦法評價不同發(fā)酵時間乳樣品GC 指紋圖譜間的相似度（表3）。

圖3 嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳中風味物質(zhì)的重疊色譜圖Fig.3 Overlapping chromatogram of S.treptococcus thermophilus fermented milks

表3 嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳GC 指紋圖譜的相似度比較Table 3 Comparison with the similarity of gas chromatographic fingerprints of S.treptococcus thermophilus fermented milks

從重疊色譜圖及相似度比較分析可以看出，該菌株發(fā)酵4 h 與發(fā)酵6 h 和前發(fā)酵之間具有較高的相似度，特別是發(fā)酵6 h 與前發(fā)酵相似度達到0.9，然而這3 個點與后熟及貯藏1，2，3，7，14 d 相似度較低，這與主成分分析的結(jié)果較為一致。后熟與貯藏1，2，3，7，14 d 的相似度分別為0.972，0.911，0.876，0.711，0.461，相似度逐漸降低，說明發(fā)酵乳在貯藏期間揮發(fā)性風味物質(zhì)在發(fā)生變化。發(fā)酵乳貯藏14 d 與4，6 h、前發(fā)酵、后熟、貯藏1，2，3 d 的風味相似度在0.282～0.461 之間，而與貯藏7 d 的相似度達到0.896，說明隨著貯藏時間的延長，發(fā)酵乳的風味差異明顯。

在本試驗中，對每組發(fā)酵乳樣品進行3 次重復測定，得到平行樣GC 指紋圖譜間的相似性均在0.92 以上，說明此方法測定發(fā)酵乳樣品的重復性較好。

3 結(jié)論

采用SPME-GC-MS 分析發(fā)酵乳制作和貯藏期間嗜熱鏈球菌IMAU80285 的揮發(fā)性風味物質(zhì)，共檢測出84種揮發(fā)性風味物質(zhì)，包括酸類化合物（11種）、醛類化合物（13種）、酮類化合物（12種）、醇類化合物（22種）、酯類化合物（9種）、烷烴類（14種）、含氮化合物（3種）。OAV 值的鑒定結(jié)果表明發(fā)酵乳中的關(guān)鍵性風味物質(zhì)（OAV>1）有16種，包括3-甲基丁醛、（E）-2-戊烯醛、辛醛、己醛、（E）-己烯醛、庚醛、（E）-2-庚烯醛、壬醛、（E）-2-癸烯醛、2，3-丁二酮、3-甲基-2-丁酮、2-壬酮、1-辛烯-3-醇、2-異丙基-5-甲基-1-庚醇、甲酸乙烯酯、乙基苯等；而其它苯甲醛、（E）-2-辛烯醛等9種揮發(fā)性風味化合物對發(fā)酵乳的整體風味起修飾作用（1>OAV>0.1）。主成分分析的結(jié)果表明發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)（OAV>0.1）在發(fā)酵初期（即發(fā)酵4，6 h）和前發(fā)酵時與貯藏期間（后熟，貯藏1，2，3，7，14 d）得到很好的區(qū)分，發(fā)酵初期（發(fā)酵4，6 h）和前發(fā)酵時的發(fā)酵乳風味與辛醛、庚醛、壬醛、己醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-2-戊烯醛、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-癸烯醛、2-壬酮、2-庚酮、3-甲基-2-丁酮、乙偶姻、2-異丙基-5-甲基-1-庚醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、己酸乙酯、甲酸乙烯酯等17種OAV≥0.1 的風味物質(zhì)有較強的相關(guān)性，而貯藏期間（后熟，貯藏1，2，3，7，14 d）的發(fā)酵乳風味與2，3-丁二酮、（E）-2-辛烯-1-醇、（E）-己烯醛、苯甲醛、3-甲基-1-丁醇、丁酸乙酯、乙基苯等7種OAV≥0.1 的風味物質(zhì)有較強的相關(guān)性；重疊色譜圖及相似度分析的結(jié)果表明，發(fā)酵乳中的風味物質(zhì)在發(fā)酵乳制作及貯藏期間變化顯著，隨著貯藏時間的延長，發(fā)酵乳的風味差異明顯。