酪蛋白凝膠顆粒對水包油型乳液穩(wěn)定性及體外消化的影響

陳 沖 張 寧 任怡鎂 王鵬杰，3*

（1 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083 2 北京工商大學 北京食品風味化學重點實驗室 北京100048 3 中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 北京100094）

水包油乳液是由水相與油相組成的分散體系，其中油相以液滴的形式分散于水相中。水包油乳狀液是食品的重要組成成分[1]，如牛奶、蛋黃醬和冰激凌等[2]。此外，水包油乳液也被用來包埋功能性物質，如色素、香精、抗菌劑、營養(yǎng)素、益生菌等[3-6]，增加這些物質的穩(wěn)定性以及促進它們的吸收。然而，水包油乳液是熱力學不穩(wěn)定體系，油-水界面存在很高的界面自由能。有研究表明，乳化劑能夠降低界面張力，是水包油乳液界面層的重要組成部分，影響界面層的結構（包括界面厚度、界面強度、電荷等），并對乳液的穩(wěn)定性和消化性能（主要是界面反應）有很大影響[7-8]。

根據(jù)乳化劑分子大小，可將乳化劑分為3類：小分子乳化劑、生物大分子乳化劑、顆粒乳化劑。小分子乳化劑具有很高的乳化性能，能夠迅速吸附到油水界面并且降低界面張力[9]。生物大分子乳化劑如蛋白類乳化劑吸附到油水界面后，發(fā)生結構的重排，從而穩(wěn)定乳液[10]。然而，小分子乳化劑和大分子乳化劑界面吸附能低，易從界面脫離，導致乳液穩(wěn)定性低。顆粒乳化劑由于界面吸附能高（能夠不可逆吸附到油水界面）[11]以及能提供更大的空間位阻（10 nm 以上）[12]，因此能更好地穩(wěn)定乳液。

目前，大部分顆粒類乳化劑均為無機顆粒如二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋁等[13-15]，食品級顆粒類乳化劑較少，如幾丁質、高溫熱變性的大豆蛋白和乳清蛋白[16-18]。不同種類的顆粒乳化劑對乳液體外消化影響不盡相同。研究表明，相比于常規(guī)商業(yè)乳化劑（如酪蛋白酸鈉、乳清蛋白等），二氧化硅、幾丁質等顆粒穩(wěn)定的乳液脂肪消化能夠被抑制[13，16]，而用乳清蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液的脂肪消化則無顯著性變化[18]。

本文用京尼平交聯(lián)自組裝的酪蛋白酸鈉制備的可食性酪蛋白凝膠顆粒，具有良好的乳化性能[19]。然而，其消化特性尚不明確。本試驗探究用酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的水包油乳液的體外消化性能，并與小分子乳化劑和生物大分子乳化劑作比較，探明乳化劑種類對水包油乳液穩(wěn)定性及體外消化的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

酪蛋白酸鈉、吐溫20、胃蛋白酶、胰脂肪酶，美國sigma 公司；中鏈甘油三酯（MCT），北京科奧科技；京尼平，成都錦泰和醫(yī)藥化學有限公司；豬膽鹽，北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

Titrino907 全自動電位滴定儀，瑞士萬通有限公司；Mastersizer 3000 激光粒度儀，Zetasizer ZEN3600，英國Malvern 公司；Scientz-IID 超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Turbiscan Tower，法國Formulaction 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酪蛋白凝膠顆粒的制備 酪蛋白凝膠顆粒的制備參照文獻[19]的方法并作一定修改，將酪蛋白酸鈉分散在水中，55 ℃下磁力攪拌3 h 至完全水合，形成10 g/L 的酪蛋白酸鈉溶液。添加0.4 g/L的疊氮化鈉抑制微生物生長并將酪蛋白酸鈉溶液pH 調至7.1。將京尼平溶解在微量無水乙醇中，與酪蛋白酸鈉溶液混合，使溶液中酪蛋白酸鈉與京尼平的質量比為20∶1。將反應體系置于50 ℃恒溫水浴中，恒溫反應24 h，調節(jié)pH 使體系的pH 維持在（7.1±0.2）。反應結束后，將體系pH 調至6.8，備用。

1.3.2 水包油乳液的制備 分別取10 mL 10 g/L的酪蛋白凝膠顆粒溶液、酪蛋白酸鈉溶液、吐溫20 溶液與等體積的MCT 在50 mL 離心管中混合，渦旋振蕩1 min 后超聲，超聲條件為：超聲1 min（開3 s，停9 s），超聲功率為190 W，變幅桿為6Φ。

1.3.3 水包油乳液穩(wěn)定性分析 采用Turbiscan穩(wěn)定性分析儀測定水包油乳液穩(wěn)定性。測定方法根據(jù)Santos等[20]的方法并稍加修改。乳液制備1 h后，將乳液混勻并倒入玻璃測量瓶中，近紅外光源（λair=880 nm）從測量瓶底到瓶頂垂直掃描，2 個同步光學探測器分別探測透過（180°）樣品的透射光和被樣品反射（45°）的背散射光。背散射光值與乳液液滴粒徑和濃度有關，乳液液滴粒徑變大，濃度下降，背散射光值下降；反之亦然。因此，通過比較測量樣品的背散射光值隨時間的變化，觀察到乳液在測定過程中是否發(fā)生乳液液滴上浮、絮凝或者聚并的現(xiàn)象。

測定程序如下：25 ℃掃描24 h，掃描頻率為10 min/次。

選取樣品中部區(qū)域的光強值，采用儀器自帶的軟件計算水包油乳液的不穩(wěn)定性指數(shù)（Turbiscan Stability Index，TSI），計算公式如下：

式中，xi——單次測量的背散射光強值；xBS——xi的平均值；n——掃描總次數(shù)。

1.3.4 水包油乳液粒徑、電位分析 采用馬爾文Mastersizer 3000 智能型激光粒度分析儀測定水包油粒徑，所有樣品測量3 次，取平均值。Zeta 電位采用Zetasizer ZEN3600 測定，所有樣品在測量之前用超純水稀釋200 倍，每個樣品測量至少3次，取平均值。

1.3.5 體外消化體系的構建 本試驗中消化過程具體步驟參考Chang等[21]的方法并作了一定的修改，具體步驟如下：

取水包油乳液1 mL，用5 mmol/L 的磷酸緩沖液（pH 7.0）（后文所有提到的緩沖液均為該緩沖液）稀釋到25 mL，預熱到37 ℃，與等體積的已經預熱到37 ℃的含有2 mg/mL NaCl 和3.2 mg/mL胃蛋白酶的模擬胃液混合，調pH 至2.0，37 ℃攪拌2 h，模擬胃部消化。

取25 mL 經過胃消化后的乳液，調pH 至7.0，然后加入1.5 mL 模擬腸液（37.47 mg/mL Ca-Cl2·2H2O，219.15 mg/mL NaCl）、3.5 mL 膽鹽溶液（54 mg/mL），調pH 至7.0，加入2.15 mL脂肪酶溶液（24 mg/mL），保持消化體系溫度為37 ℃，pH 為7.0，持續(xù)2 h，模擬腸消化。

1.3.6 水包油乳液粒徑分析 初始的水包油乳液以及經過模擬胃、腸消化后的乳液的粒徑采用馬爾文Mastersizer 3000 智能型激光粒度分析儀測定。所有樣品測量3 次，取平均值。

1.3.7 水包油乳液Zeta 電位分析 水包油乳液Zeta 電位采用Zetasizer ZEN3600 測定，所有樣品在測量之前用相應的無酶消化液（如胃相中的乳液采用不含胃蛋白酶的模擬胃液稀釋）稀釋相應倍數(shù)，使體系最終稀釋倍數(shù)與初始乳液稀釋倍數(shù)相同，每個樣品測量至少3 次，取平均值。

1.3.8 脂肪酸釋放的測定 油滴經過脂肪酶的作用后水解為甘油單脂和游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA），采用Titrino907 全自動電位滴定儀的pH-stat 模式維持體系pH 值并記錄所消耗的NaOH，計算游離脂肪酸的含量。假設一分子甘油三酯完全水解為一分子甘油單脂和兩分子游離脂肪酸，那么釋放的游離脂肪酸（FFA）的百分含量可以采用如下公式計算[21]：

式中，VNaOH——反應中中和游離脂肪酸的NaOH 的體積，mL；mNaOH——NaOH 溶液的濃度，0.1 mol/L；Mlipid——MCT 的分子質量，372.54 g/mol；wlipid——MCT 在消化前的總質量，0.235 g。1.3.9 統(tǒng)計分析方法 每個試驗重復3 次，采用平均值±標準差來表示結果，采用SPSS 20 進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 用酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的水包油乳液穩(wěn)定性

圖1 用不同種類乳化劑穩(wěn)定的乳液的穩(wěn)定性Fig.1 Stability of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

2.1.1 乳化劑種類對水包油乳液穩(wěn)定性的影響乳化劑種類對水包油乳液穩(wěn)定性的影響如圖1所示。TSI 與乳液的穩(wěn)定性成反比。結果表明，隨著時間的延長，乳液的不穩(wěn)定性增加，這是因為連續(xù)相與分散相之間的密度差致使乳液液滴上浮，隨著時間的延長上浮現(xiàn)象越嚴重，不穩(wěn)定性增加。樣品中部區(qū)域光強值的變化主要反映乳液的聚集或者聚并情況[22]，而對于3種不同的乳化劑來說，酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的水包油乳液TSI 最低，表明酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定乳液的能力顯著高于吐溫20和酪蛋白酸鈉且能有效抑制乳液的聚集。

2.1.2 乳化劑種類對水包油乳液粒徑的影響 圖2是3種乳化劑穩(wěn)定的乳液的粒徑大小。結果顯示，在相同乳化條件下，不同乳化劑穩(wěn)定的乳液粒徑大小排列順序為酪蛋白凝膠顆粒>酪蛋白酸鈉>吐溫20，這可能與乳化劑的乳化性能相關。在乳化過程中，小分子乳化劑能夠迅速吸附到油水界面形成乳液，乳化能力強，因而導致粒徑小；蛋白類乳化劑吸附到油水界面的速率相對較慢[23]。而基于自組裝酪蛋白結構的酪蛋白凝膠顆粒乳化性能相比于酪蛋白酸鈉更低，這是因為酪蛋白酸鈉在油水界面會分解并發(fā)生親水疏水基團的重排，而酪蛋白凝膠顆粒則保持完整的結構吸附在油水界面。此外，由于在油水界面保持完整的結構[19]，酪蛋白凝膠顆粒也對水包油乳液的粒徑產生了一定影響[19]。

2.1.3 乳化劑種類對水包油乳液Zeta 電位的影響 圖3是3種乳化劑穩(wěn)定的乳液的Zeta 電位大小，結果顯示，酪蛋白酸鈉和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液具有較高的負電荷且大小相近，這是因為酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒帶有相近的負電位，吸附到油水界面后形成界面層，由于酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒自身所帶電荷使乳液液滴具有較高的負電荷。吐溫20是非離子表面活性劑，因此預料由其包被的乳液液滴將不帶電荷。然而本試驗中該乳化劑穩(wěn)定的乳液液滴帶少量負電，這可能是由于表面活性劑或油中存在游離脂肪酸雜質，或者油滴表面選擇性吸附OH-（而不是H+）引起的[21]。

吐溫20 穩(wěn)定的乳液雖然粒徑小，但是由于帶電量小，界面厚度?。ㄐ∮? nm），從而導致靜電排斥作用和空間位阻小，因此隨著時間的遷移乳液逐漸聚集，穩(wěn)定性下降。酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液雖然帶電量高，界面厚度相對較高（1～10 nm）[12]，但是由于連續(xù)相中酪蛋白酸鈉濃度較高，引起排斥絮凝現(xiàn)象[24]，即當相互靠近的乳液液滴距離小于酪蛋白分子大小時，相鄰液滴間的滲透壓低于連續(xù)相中的滲透壓，因此對相鄰的液滴產生一個作用力使乳液液滴聚集，乳液不穩(wěn)定。酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液靜電斥力較高且不可逆吸附在油水界面，形成厚而致密的保護層防止絮凝，從而提高乳液的穩(wěn)定性。

圖2 不同種類乳化劑穩(wěn)定的乳液粒徑Fig.2 Droplets size of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

圖3 不同種類乳化劑穩(wěn)定的乳液Zeta 電位Fig.3 Zeta potential of oil-in-water emulsions stabilized by different kinds of emulsifiers

2.2 酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的水包油乳液體外消化特性研究與比較

2.2.1 不同種類乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液體外消化過程中的粒徑變化 圖4是3種乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液經過模擬體外消化過程中乳液粒徑的變化。3種乳化劑穩(wěn)定的乳液粒徑隨著消化的進行而增加，且粒徑分布范圍變大。經過胃消化后，3種乳液的粒徑都顯著增加，但是吐溫20 穩(wěn)定的乳液粒徑增加幅度相對較小，為初始粒徑的1.57倍，而酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液粒徑分別變?yōu)槌跏剂降?.98 倍和2.86 倍。吐溫20穩(wěn)定的乳液粒徑增加可能是因為在胃pH 以及較高鹽離子濃度的環(huán)境下，水包油乳液液滴表面負電被中和而導致乳液液滴絮凝。酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液粒徑顯著增加可能是因為模擬胃液中的胃蛋白酶降解了酪蛋白，從而使得界面上的酪蛋白脫落，乳液液滴發(fā)生絮凝、聚并導致乳液液滴粒徑變大。經過小腸消化后，3種乳液粒徑均顯著增加。這是因為模擬腸液中的膽鹽能夠取代存在于油水界面的吐溫20 以及被降解的酪蛋白分子，脂肪酶隨后降解膽鹽覆蓋區(qū)域的甘油三酯。甘油三酯水解形成的產物有一定的乳化性能，但是由于它們較低的表面黏度和彈性，使得乳液更趨向于聚并從而導致乳液粒徑變大[25]。粒徑的變化表明在油水界面的酪蛋白凝膠顆?？赡茉谖赶倪^程中被胃蛋白酶降解，從而在進入小腸消化階段不能保持完整的顆粒結構，最終無法像二氧化硅納米顆粒、幾丁質顆粒一樣抑制脂肪的消化[13，16]。

圖4 乳液在體外消化過程中粒徑分布圖Fig.4 Size distribution of oil-in-water emulsions during in vitro digestion

2.2.2 不同種類乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液體外消化過程中的Zeta 電位變化 通過測定乳液的Zeta電位，考察模擬消化過程中不同種類乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液界面吸附特性。不同種類乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液隨著消化的進行Zeta 電位變化情況如圖5所示。經過模擬胃消化后，酪蛋白和酪蛋白顆粒穩(wěn)定的乳液Zeta 電位發(fā)生顯著性變化，由帶負電變?yōu)檎姟＿@主要是因為模擬胃液的pH是2，在酪蛋白的等電點以下，因此Zeta 電位為正。而吐溫20 穩(wěn)定的乳液負電荷被中和，因此帶正電。此外，酪蛋白穩(wěn)定的乳液的Zeta 電位值接近零而不是在明顯低于酪蛋白酸鹽等電點（約為pH 4.8）的pH 值下所預期的帶大量正電荷。這可能是由于吸附到油滴表面的蛋白質分子的部分或完全水解從而改變界面組成和性質。這樣的Zeta值不足以穩(wěn)定乳液，因此可能造成乳液的絮凝和聚并從而導致乳液粒徑變大。所有乳液在小腸消化后顯示出帶有相對高的負電荷而且絕對值相差不大。這表明經過小腸消化后，原有的由乳化劑（吐溫20、酪蛋白以及酪蛋白凝膠顆粒）形成的界面層已經完全被取代。這些電荷可能源于消化物中存在各種類型的陰離子顆粒物質（例如未消化的蛋白質聚集體，未消化的脂滴，膠束或囊泡），它們表面具有帶負電荷的物質（例如肽或游離脂肪酸）[21]。

圖5 乳液在體外消化過程中Zeta 電位的變化Fig.5 Changes in Zeta potential of oil-in-water emulsions during in vitro digestion

2.2.3 不同種類乳化劑穩(wěn)定的水包油乳液體外消化過程中的脂肪酸釋放變化 使用pH-stat 方法測定乳化劑類型對脂質消化的影響。如圖6所示，3種乳化劑穩(wěn)定的乳液總的脂肪酸釋放量沒有顯著性差異，表明本試驗中乳化劑種類沒有影響最終的消化結果，但是消化過程有差異。吐溫20 穩(wěn)定的乳液在初始階段游離脂肪酸的釋放快速增加，在之后更長時間內逐漸增加，直到達到頂點。而酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液則先緩慢消化，然后快速上升，最后到達頂點。這些現(xiàn)象可能與小腸消化開始時酪蛋白和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液粒徑遠大于吐溫20 穩(wěn)定的乳液有關，因為吐溫20 穩(wěn)定的乳液粒徑小，比表面積大，與膽鹽和脂肪酶反應面積就大，所以油滴更易被脂肪酶降解。而且大分子乳化劑形成的界面膜對膽鹽取代的抵抗能力也比小分子乳化劑強。酪蛋白穩(wěn)定的乳液消化曲線和酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液幾乎相同，證實了在模擬胃的消化過程中，酪蛋白凝膠顆粒已經被蛋白酶降解，不再保持完整的顆粒結構，因此并不會抑制脂肪消化。

圖6 乳液在體外消化過程中游離脂肪酸的釋放Fig.6 Free fatty acid release of the emulsions during in vitro digestion

3 結論

本文研究了自組裝的酪蛋白酸鈉經京尼平交聯(lián)之后形成的酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液的穩(wěn)定性和體外消化性能，并與吐溫20 和酪蛋白酸鈉進行比較。結果顯示，酪蛋白凝膠顆粒穩(wěn)定的乳液穩(wěn)定性最好，這與酪蛋白凝膠顆粒能以完整的顆粒結構存在于油水界面并形成強大的空間位阻和靜電效應有關。不同種類的乳化劑對水包油乳液的初始消化有影響，酪蛋白凝膠顆粒和酪蛋白酸鈉初始消化速率低，這與乳液的粒徑和乳化劑形成的界面層結構相關，但是并不影響消化終點。此外，酪蛋白凝膠顆粒與酪蛋白酸鈉的消化曲線無顯著性差異，可能是因為酪蛋白凝膠顆粒在胃消化階段被胃蛋白酶降解從而導致顆粒結構被破壞。由此表明，酪蛋白凝膠顆粒能夠更好地穩(wěn)定水包油乳液且不影響其消化。