中藥注射劑類過敏反應(yīng)研究進展

文雯　梁慧慧　余格　趙 靖　李原華　劉文龍　劉紅宇

〔摘要〕 中藥注射劑（traditional chinese medicine injections，TCMIs）臨床療效確切，但其類過敏反應(yīng)頻發(fā)，日益增多的不良反應(yīng)事件已成為當(dāng)前中藥安全性研究的熱點和難點。類過敏反應(yīng)的發(fā)生機制尚未完全明確，其常規(guī)評價標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險防控措施還存在一定局限性，亟需建立一套能廣泛篩查TCMIs類致敏原、明確類致敏發(fā)生機制的TCMIs安全性評價方法。本文對近年來有關(guān)TCMIs類過敏反應(yīng)的機制、物質(zhì)基礎(chǔ)以及評價方法的研究進行綜述，旨在深入挖掘TCMIs類過敏反應(yīng)的綜合信息，以期為建立TCMIs類過敏反應(yīng)評價與風(fēng)險防控新方法、減少TCMIs臨床不良反應(yīng)的發(fā)生提供新的思路。

〔關(guān)鍵詞〕 中藥注射劑;類過敏反應(yīng);不良反應(yīng);物質(zhì)基礎(chǔ);細(xì)胞模型;動物模型

〔中圖分類號〕R28? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.026

〔Abstract〕 Traditional Chinese medicine injections （TCMIs） have definite clinical efficacy， while their anaphylactoid reactions are frequent， and the increasing number of adverse reaction events has become a hot and difficult point in the research of Chinese materia medica safety. The mechanism is not completely clear， and there are still some limitations in conventional evaluation criteria and risk control measures. It is urgent to establish the safety evaluation methods for TCMIs， which can widely screen the allergens and clarify the mechanism of anaphylactoid reactions. In this paper， the research on the mechanism， material basis and evaluation methods of TCMIs anaphylactoid reactions in recent years were reviewed. The purpose is to dig out the comprehensive information related to the reactions， in order to provide the ideas for establishing a new risk control method for anaphylactoid reaction evaluation， so as to reduce the occurrence of clinical adverse reactions of TCMIs.

〔Keywords〕 traditional Chinese medicine injections; anaphylactoid reactions; adverse reactions; material base; cell model; animal model

中藥注射劑（traditional chinese medicine injections，TCMIs）是由中醫(yī)藥理論指導(dǎo)，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與方法，從中藥、天然藥物的單方或復(fù)方中提取有效物質(zhì)制成的可供注入體內(nèi)（包括肌內(nèi)、穴位、皮內(nèi)、皮下、靜脈以及其他組織或器官）的滅菌制劑以及供臨床前配制溶液的無菌粉末或濃縮液[1]。TCMIs療效確切、生物利用度高、起效快，解決了中醫(yī)臨床沒有急癥用藥的痼疾[2-3]。近年來，TCMIs的發(fā)展道路頗為坎坷，原因是隨著臨床的廣泛應(yīng)用以及不良反應(yīng)監(jiān)測力度增強，有關(guān)TCMIs的不良反應(yīng)報道越來越多，在國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心發(fā)布的《國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測年度報告（2017年）》中，TCMIs占中藥不良反應(yīng)/事件報告的54.6%[4]。TCMIs的臨床安全飽受爭議，給TCMIs行業(yè)敲響了警鐘。自2006年魚腥草注射液不良反應(yīng)事件爆發(fā)至今，國家食藥總局已宣布限用、禁用多種TCMIs，并要求部分品種修改說明書。

TCMIs的不良反應(yīng)以（類）過敏反應(yīng)為主[5]，其中類過敏反應(yīng)（Anaphylactoid reactions）約占77%，主要表現(xiàn)在皮膚、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等，包括皮膚黏膜紅腫、瘙癢、腹痛、惡心、胸悶、呼吸困難以及血壓下降等癥狀，甚至?xí)l(fā)生休克和死亡[6]。類過敏反應(yīng)的發(fā)生機制尚未完全明確，其常規(guī)評價標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險防控措施還存在一定局限性，亟需建立一套能廣泛篩查TCMIs的類致敏原、明確類致敏機制的TCMIs類過敏反應(yīng)評價方法。本文將從TCMIs引發(fā)類過敏反應(yīng)的機制、物質(zhì)基礎(chǔ)和評價方法三個方面對近年的相關(guān)研究作出綜述，并對研究存在的不足展開討論，以期為進一步研究和風(fēng)險防控新方法的建立提供思路和參考。

1 類過敏反應(yīng)發(fā)生的機制

TCMIs類過敏反應(yīng)的發(fā)生機制可能與肥大細(xì)胞（mast cell，MC）脫顆粒釋放組胺（Histamine， HIS）、補體系統(tǒng)的激活、花生四烯酸代謝等有關(guān)，可通過以下幾個環(huán)節(jié)激發(fā)。

1.1? 直接刺激MC

潘衛(wèi)松等[7]研究發(fā)現(xiàn)，清開靈注射液（Qingkailing injection，QKLI）不含HIS類物質(zhì)的情況下可引發(fā)小鼠類過敏反應(yīng)，且MC膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉（可抑制MC脫顆粒）對其具有干預(yù)作用，提示QKLI可直接刺激MC脫顆粒釋放內(nèi)源性HIS從而引發(fā)小鼠類過敏反應(yīng)。

1.2? 補體激活

血清補體主要有C1～C9[8]等9種，激活的途徑有激活經(jīng)典途徑、激活旁路途徑和甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）途徑，這3條途徑最終都是通過形成C3轉(zhuǎn)化酶，釋放C3a、C5a過敏毒素等補體活化片段，可與MC表面的C3aR和C5aR結(jié)合，使體內(nèi)外靶細(xì)胞脫顆粒，引起機體類過敏反應(yīng)。樊孟[9]研究發(fā)現(xiàn)雙黃連注射液（Shuanghuang？鄄lian injection，SHLI）和香丹注射液均可通過補體激活相關(guān)機制致小鼠類過敏，此外還有研究表明，脂質(zhì)體、聚氧乙烯蓖麻油（cremophor EL，erEL）、造影劑RCM和吐溫-80等均可激活補體系統(tǒng)途徑而致敏[10-11]。

1.3? 激活Ca2+通道

TCMIs致敏原可通過激活G蛋白，進而激活蛋白激酶C和Ca2+相關(guān)信號通路，胞內(nèi)Ca2+濃度上升時，RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒并釋放HIS、β-氨基己糖苷酶等生物介質(zhì)，從而致類過敏發(fā)生[12-13]。

1.4? 其他通道

張波等[14]在QKLI誘發(fā)類過敏反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)QKLI可激活RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶（ phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、Rac1、PAK1蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排，PAK1同時可激活LIMK1酶，LIMK1酶再反向激活Cofilin。因此致使RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)PI3K活性提高，使Rac1、PAK1、LIMK1和Cofilin蛋白含量呈劑量性增高，提示QKLI的類過敏反應(yīng)可能是由基于細(xì)胞流動性改變，PI3K-Rac1細(xì)胞運動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞骨架重排所致。

2 類過敏反應(yīng)發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)

引起TCMIs類過敏反應(yīng)的因素是多方面的，如藥物制備工藝不規(guī)范，使制劑內(nèi)大分子物質(zhì)殘留[15]，臨床上不按中醫(yī)證候辨證施治原則施藥、配伍不當(dāng)、超適應(yīng)癥和超劑量給藥[16-18]，以及患者的個體差異（年齡、性別）[19-20]等。在TCMIs致類過敏反應(yīng)的相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)研究中，發(fā)現(xiàn)其輔料和原藥材成分皆具有類致敏性。

吐溫-80常作為增溶性輔料應(yīng)用于TCMIs。已有研究證明吐溫-80和魚腥草注射液存在的嚴(yán)重不良反應(yīng)有密切關(guān)系[21]。吐溫-80導(dǎo)致的類過敏反應(yīng)，可能與其外源性大分子雜質(zhì)有關(guān)[22]，目前的工藝還無法完全除去這些雜質(zhì)。TCMIs的成分TCMIs由植物原藥材提取加工而成，成分多且復(fù)雜，部分成分同時也具有類致敏作用。如SHLI中的綠原酸、隱綠原酸和黃芩苷可使HBL-2H3細(xì)胞脫顆粒[23-24];人參皂苷Rd和人參皂苷20（S）-Rg3能顯著提高RBL-2H3細(xì)胞中HIS、β-己糖胺酶的釋放和磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)移，增加MPMCs和LAD2細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[25-26];靜脈注射三七總皂苷制劑可引起小鼠耳廓血管通透性增高，耳廓明顯藍(lán)染肥大以及MC脫顆?，F(xiàn)象[27]，均提示以上成分具有潛在的類致敏作用。此外小分子物質(zhì)5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF）廣泛存在于糖類TCMIs中，其濃度較高時還可檢測到一定濃度的二聚體雙-（5-甲?；坊┟眩?，5'-Oxydimethylenebis（2-furfural），OBMF），林琳[28]首次發(fā)現(xiàn)二者可引起體外MC發(fā)生類過敏反應(yīng)和Ⅰ型超敏反應(yīng)，后者的生成會增加前者的免疫毒性。

3 類過敏反應(yīng)的評價方法

3.1? 體外細(xì)胞模型

3.1.1? MC模型? 類過敏體外實驗研究一般都采用原肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞，MC是類過敏反應(yīng)主要效應(yīng)細(xì)胞，其能通過脫顆粒分泌HIS，各種炎癥和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)從而引起機體生理及病理的變化[29-30]。這類模型多以靶細(xì)胞為研究對象，探求其類過敏介質(zhì)的釋放機制，細(xì)胞脫顆粒率、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化、HIS、β-己糖苷酶為RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的重要評價指標(biāo)[31]。常用的MC如下。

RBL-2H3細(xì)胞具有MC的許多生物學(xué)特性，具有靈敏、快速、方便的特點，現(xiàn)已廣泛用于藥物類過敏反應(yīng)的體外研究。范姍姍等[32]建立了基于實時細(xì)胞分析（real-time cell analysis，RTCA）系統(tǒng)的RBL-2H3細(xì)胞類過敏反應(yīng)評價方法，以細(xì)胞指數(shù)（cells index，CI）、細(xì)胞形態(tài)、骨架變化和HIS和β-已糖苷酶釋放量為考察指標(biāo)，可敏感的評價RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒，并已成功用于20個批次的注射用益氣復(fù)脈（凍干）的類過敏反應(yīng)評價。Han Shengli等[24]建立了RBL-2H3/CMC在線液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（LC/MS），通過體外RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒、己糖胺酶釋放實驗和LC/MS的成分篩查，成功鑒定出黃芩苷是SHLI中潛在的類致敏原。王化龍等[33]運用RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒模型與高內(nèi)涵檢測結(jié)合的方法，對細(xì)胞脫顆粒囊泡和細(xì)胞核染色標(biāo)記，計算出30批次紅花注射液的細(xì)胞脫顆粒率，驗證了紅花注射液的類致敏作用，與傳統(tǒng)方法檢測的結(jié)果高度一致，是一種更靈敏、可靠且可實現(xiàn)高通量篩選的新評價手段。韓森等[34-35]建立的RBL-2H3細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度及致敏介質(zhì)檢測的方法比傳統(tǒng)方法更加方便、快捷，同時還可以避免β-氨基己糖苷酶檢測方法中因藥物顏色干擾而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，具有較高的應(yīng)用前景。

小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞P815因具有MC的特殊性質(zhì)而被發(fā)現(xiàn)，逐漸被用于體外過敏反應(yīng)研究[36]。Peng Bo等[37]發(fā)現(xiàn)在相同刺激條件下，compound40/80（C48/80）激活RBL-2H3和P815后，后者細(xì)胞過敏介質(zhì)釋放率、Annexin V陽性率和脫顆粒率均高于前者細(xì)胞，后者活化后脫顆?，F(xiàn)象出現(xiàn)更早、程度更高?？梢钥闯?，P815細(xì)胞較RBL-2H3細(xì)胞在脫顆粒的研究中靈敏度更高，可作為一種早期TCMIs過敏反應(yīng)評價模型。

馮宇飛等[38]通過建立大鼠腹腔肥大細(xì)胞（rat per-i onealmast cells， RPMC）模型研究SHLI類過敏反應(yīng)，結(jié)果顯示RPMC脫顆粒實驗指標(biāo)變化不明顯，提示組方中的3種主要有效成分與類過敏反應(yīng)無直接關(guān)系。

3.1.2? 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）? Han等[39]建立了將HUVEC單層與SHLI（0.05、0.1或0.15 mg/mL）一起孵育，以內(nèi)皮通透性和細(xì)胞骨架的變化為觀察指標(biāo)，并結(jié)合蛋白質(zhì)印跡分析的方法，發(fā)現(xiàn)SHLI可誘導(dǎo)產(chǎn)生類過敏反應(yīng)。

3.2? 動物模型

類過敏研究主要用到的實驗動物有Beagle犬、大鼠、小鼠、豚鼠等[40]，不同品種或品系的動物的類過敏反應(yīng)易感性和表現(xiàn)不同[41]。

3.2.1? 大鼠? 大鼠皮膚類過敏試驗敏感、可靠，適宜于注射劑臨床前類過敏反應(yīng)評價。目前大鼠的類過敏反應(yīng)評價指標(biāo)主要是藍(lán)斑直徑、藍(lán)斑直徑結(jié)合伊文思藍(lán)（evens blue，EB）滲出量，也可以選定皮膚藍(lán)斑OD與對照部位皮膚藍(lán)斑OD比值（K）作為評定標(biāo)準(zhǔn)[42]。梁愛華等[43-44]建立了基于改良Miles Assay法的大鼠皮膚類過敏模型，給大鼠皮內(nèi)注射不同稀釋度的紫杉醇注射液和鹽酸胺碘酮注射液，尾靜脈注射指示劑EB，皮內(nèi)藍(lán)斑直徑和EB滲出量結(jié)果顯示2種注射劑均可使皮膚形成較大范圍的藍(lán)斑，提示可引起類過敏反應(yīng)，與臨床結(jié)果具有很好的一致性。陳桂榮等[45]創(chuàng)新性地將iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)研究結(jié)合BN大鼠類過敏反應(yīng)模型，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度成功鑒定出7個C48/80誘導(dǎo)類過敏反應(yīng)的候選生物標(biāo)志物。

3.2.2? 小鼠? 建立小鼠類過敏反應(yīng)模型時，通常采用血管通透性實驗，根據(jù)耳廓藍(lán)染動物數(shù)、耳廓藍(lán)染發(fā)生率、腹部黏膜藍(lán)斑和EB滲出量來綜合評價類過敏反應(yīng)強度[9]。張宇實等[46]以耳廓藍(lán)染發(fā)生率和EB滲出量作為TCMIs類過敏反應(yīng)評價指標(biāo)，比較不同品系、年齡的小鼠的敏感性。結(jié)果顯示，ICR敏感度最高，昆明小鼠次之，BALB/C和C57小鼠敏感性較低，提示可選用前2種小鼠作為模型動物。此外，雄性小鼠對類過敏實驗更為敏感。易艷等[47]建立ICR小鼠類過敏模型結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用成功分離出并確定連翹酯苷A是SHLI的主要類致敏成分之一。練雪萍開展了人參皂苷Rd致小鼠急性類過敏反應(yīng)研究，結(jié)合代謝組學(xué)研究成功鑒定出共20個可能與類過敏有關(guān)的差異代謝物[48]。

3.2.3? 豚鼠? 梁愛華等[49]建立了TCMIs類過敏豚鼠模型，該模型證明了吐溫-80是主要的類致敏物質(zhì)，靜注含吐溫-80的受試藥物的豚鼠，會發(fā)生耳廓血管通透性增高，且反應(yīng)呈劑量依賴性，而注射不含吐溫-80的受試藥物的豚鼠，未發(fā)生該反應(yīng)。

3.2.4? Beagle犬? 梁愛華等[50]用Beagle犬進行TCMIs的類致敏試驗發(fā)現(xiàn)Beagle犬對吐溫-80具有高敏感度，其首次注射0.5%吐溫-80和含吐溫-80魚腥草注射液后很快出現(xiàn)皮膚局部紅腫、瘙癢，精神狀態(tài)變差，血壓降低、呼吸和心率加快等與臨床上人的類過敏反應(yīng)相似的癥狀，提示Beagle犬可作為臨床前評價TCMIs類過敏反應(yīng)動物模型，該模型靈敏度高、重復(fù)性好、與臨床具有高度一致性。李漢成等[51]考慮到臨床患者的狀態(tài)，建立了環(huán)磷酰胺致免疫低下Beagle犬模型，通過比較免疫低下與正常Beagle犬在靜脈注射腫節(jié)風(fēng)注射液后的類過敏反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)30 min內(nèi)免疫低下組HIS含量升高較正常組顯著，即免疫低下組類過敏反應(yīng)強度大于正常對照組，結(jié)果提示該模型的建立有效。

4 討論

4.1? TCMIs主要是通過直接或間接刺激MC脫顆粒而致敏，目前有關(guān)機制的研究大多停留在MC脫顆粒及介質(zhì)釋放。然而，TCMIs類致敏機制是多成分多靶點多環(huán)節(jié)的。在TCMIs進入人體后至刺激MC的過程中，致敏性是源自其組分自身，還是源自其組分進入機體內(nèi)反應(yīng)生成的新物質(zhì)，MC的激發(fā)通路是由類致敏性成分直接刺激還是涉及一個或多個通路間接刺激，這些問題值得重度與深度的研究。

4.2? TCMIs引發(fā)的類過敏反應(yīng)涉及到體內(nèi)外多環(huán)節(jié)的因素，由于體外的制劑、用藥等環(huán)節(jié)的因素皆為可控因素，而藥物類致敏成分的復(fù)雜性、不穩(wěn)定性，以及成分進入機體內(nèi)部引發(fā)類過敏所發(fā)生的各種復(fù)雜反應(yīng)才是目前的研究難點，因此應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范其制備工藝與臨床合理用藥，降低其在臨床使用中的不良反應(yīng)發(fā)生率，以便更全面研究TCMIs在體內(nèi)引起類過敏反應(yīng)的原因。如吐溫-80仍在作為輔料用于一部分現(xiàn)存TCMIs，存在極大的安全隱患，可嘗試尋找其他安全性高的輔料替代，以降低其類過敏發(fā)生風(fēng)險。

4.3? 目前已探索出多種細(xì)胞、動物類過敏反應(yīng)模型，通過這些模型成功確定了多種TCMIs的類致敏原，并推出了相關(guān)類致敏通路和機制。然而，我國的《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光變態(tài)反應(yīng)）研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[52]中迄今尚未制定關(guān)于類過敏試驗的指導(dǎo)原則，有關(guān)評價方法仍然缺乏，實驗中的觀察指標(biāo)缺乏客觀性，不利于TCMIs的臨床應(yīng)用與發(fā)展。因此，有必要修訂和完善類過敏試驗的評價標(biāo)準(zhǔn)及指導(dǎo)原則。此外，由于種屬差異性和藥物性質(zhì)差異等，體外細(xì)胞模型并不能完全預(yù)測TCMIs類過敏反應(yīng)。如藥物濃度和細(xì)胞毒作用影響RBL-2H3細(xì)胞導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差;致敏性成分檢測結(jié)果呈假陰性，非致敏性成分檢測結(jié)果呈假陽性等。大多數(shù)研究是通過單一模型對單成分的單通路類致敏反應(yīng)檢測，對于這些成分多以是否具有致敏性的研究為主，研究結(jié)果具有局限性。受練雪萍、劉曉娟等[48，53]的研究的啟發(fā)，可以推測TCMIs進入生物系統(tǒng)后，起效（毒）的可能是復(fù)方中的原形成分或代謝產(chǎn)物，或是與機體作用形成的新成分（可能涉及到機體能量代謝、分子信號傳導(dǎo)或免疫炎癥反應(yīng)等方面），三者構(gòu)成體內(nèi)中藥成分的代謝物組，進而通過多靶點、多系統(tǒng)綜合干預(yù)人體內(nèi)源性代謝物組來起作用，致使機體發(fā)生類過敏反應(yīng)。因此，在進行TCMIs的安全性評價時，可以先基于體外MC模型進行早期的TCMIs類致敏性評價，并找出其一級致敏通路，同時建議研究時參考臨床劑量，設(shè)多個濃度組，再根據(jù)TCMIs的有效成分、輔料的性質(zhì)特點，結(jié)合前期的研究資料，選用較為敏感的動物模型，進行體內(nèi)類致敏試驗，深入蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等研究，嘗試多種方法相聯(lián)合全面探索出類過敏反應(yīng)作用機制。本課題組基于此，現(xiàn)已開展基于代謝組學(xué)的中藥注射劑類致敏成分與機制的研究工作。此外結(jié)合臨床建立不同免疫狀態(tài)的動物模型來評價TCMIs類致敏性也值得研究。

5 展望

TCMIs作為中藥發(fā)展進程的一個重要里程碑，其安全性問題已成為公眾關(guān)注的焦點，急需基于現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)，更系統(tǒng)性地篩查類致敏原，推測作用通路，明確類致敏作用機制，以期盡早實現(xiàn)TCMIs類過敏反應(yīng)風(fēng)險評價與防控新方法的建立。這將對TCMIs的臨床用藥安全意義重大。

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（本文編輯? 匡靜之）