濕熱-痰結(jié)-瘀毒型小鼠腸癌模型的建立

曹文　周小青

〔摘要〕 目的 建立一種濕熱-痰結(jié)-瘀毒的大腸癌動物模型，為中醫(yī)藥預防大腸癌實驗的多方位多角度開展提供模型保障。方法 將60只雄性小鼠隨機分為實驗A組、B組及C組，每組20只。A組腹腔注射氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM） 12.5 mg/kg;B組腹腔注射AOM 10 mg/kg ;C組一直為空白組，腹腔注射等量生理鹽水，均1次。隨后A、B兩組行3個循環(huán)周期，自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉5 d+自由飲用無菌用水16 d為1個循環(huán)周期;C組自由飲用無菌用水，3組均采用高脂顆粒飼料喂養(yǎng)。造模結(jié)束后，斷頸處死小鼠觀察其瘤體組織變化。結(jié)果 與C組比較，A組和B組的造模前后的體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），B組體質(zhì)量變化大于A組（P<0.05）;A組腺癌成癌率較高，B組腺瘤成瘤率較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;造模過程中A組死亡率大于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組織病理學顯示A組腺癌細胞排列紊亂，乳頭內(nèi)間質(zhì)少;B組腺瘤細胞排列呈大小不一的管狀結(jié)構(gòu)，腺上皮細胞數(shù)目增多，核細長，呈不同程度的異型性。結(jié)論 AOM 10 mg/kg劑量組適合腺瘤（痰結(jié)）模型，AOM 12.5 mg/kg更適合惡性腫瘤（瘀毒）模型。

〔關(guān)鍵詞〕 結(jié)直腸癌;中醫(yī)證候模型;氧化偶氮甲烷;高脂顆粒飼料

〔中圖分類號〕R273? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.009

〔Abstract〕 Objective To establish an animal model of colorectal cancer with damp-heat， phlegm-stagnation， stasis-toxin， and to provide model guarantee for the experiment of preventing colorectal cancer by traditional Chinese medicine （TCM）. Methods A total of 60 male mice were divided into an experimental group A （n = 20）， a group B （n = 20）， and a group C （n = 20）. Group A was given intraperitoneal injection for AOM 12.5 mg/kg. Group B was given intraperitoneal injection for AOM 10 mg/kg. Group C was the blank group and was given intraperitoneal injection for the same amount of normal saline， all for once. Subsequently， Group A and B performed 3 cycles， and free drinking of 2.5% dextran sodium sulfate for 5 d + free drinking of sterile water for 16 days was a cycle; Group C had free drinking of sterile water for 3 cycles， and all of the 3 groups had high-fat pellet feed. After the modeling was completed， the mice were sacrificed by breaking neck to observe their tumor tissue changes. Results Compared with the group C， the differences in body weight before and after modeling were statistically significant in group A and group B （P<0.05）. The change in body weight in group B was greater than that in group A （P<0.05）; The adenocarcinoma formation rate of group A was higher， and the adenocarcinoma formation rate of group B was higher. The differences were statistically significant （P<0.05）. The mortality of group A was greater than that of group C during the modeling process， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Histopathology showed disordered arrangement of adenocarcinoma cells in group A with less interstitial nipples; adenoma cells in group B had tubular structures of different sizes， increased number of glandular epithelial cells， slender nuclei， and different degrees of atypical. Conclusion AOM 10 mg/kg dose group is suitable for adenoma （phlegm-stagnation） model， and AOM 12.5 mg/kg is more suitable for malignant tumor （stasis-toxin） model.

〔Keywords〕 colorectal cancer; TCM syndrome model; azomethane; high-fat pellet feed

結(jié)直腸癌是我國消化系統(tǒng)常見腫瘤，近30年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率年均上升3%～4%，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡例數(shù)卻分別占全世界發(fā)病和死亡總例數(shù)的18.6%和20.1%，均居第1位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，80%以上的結(jié)直腸癌是由結(jié)直腸腺瘤演變發(fā)展而來，結(jié)直腸腺瘤被認為是重要的結(jié)直腸癌的癌前病變[2]。正常的結(jié)直腸上皮細胞在炎癥、酒精等因素作用下過度增生，形成向腸腔突出的隆起性病變，由早期腺瘤向晚期腺瘤發(fā)展，并最終形成惡性腫瘤，即結(jié)直腸癌的“腺瘤-癌序貫學說”。中醫(yī)學認為大腸癌是濕熱-痰結(jié)-瘀毒的演變過程，與“腺瘤-癌序貫學說”吻合。且中醫(yī)藥抗癌在預防腫瘤復發(fā)方面大有前途，但目前臨床研究最常用的結(jié)直腸癌動物模型是移植瘤模型，盡管該模型成瘤率高，但不能模擬我們中醫(yī)腫瘤病理病機演變過程，限制了中醫(yī)藥預防及抗腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移實驗的進行。而嚙齒類動物模型模擬腺瘤-癌的發(fā)病過程，更接近人類大腸癌發(fā)病機制[3]。研發(fā)濕熱-痰結(jié)-瘀毒的大腸癌動物模型，可為中醫(yī)藥預防大腸癌實驗提供多方位多角度模型保障。

本課題采用高脂飲食聯(lián)合氧化偶氮甲烷（Azoxymethane， AOM）及葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium， DSS）模擬腸炎誘導腸癌發(fā)生過程。國內(nèi)大多數(shù)資料報道均是用AOM 10 mg/kg腹腔注射1次，然后自由飲用2%～3%的DSS 5 d，3～4周期[4-6]。國外相關(guān)文獻AOM 10～15 mg/kg腹腔注射1次較多[7-8]，為了使造模成功率更高，穩(wěn)定性更好，我們在本課題探索了兩種AOM劑量，分別是10.0、12.5 mg/kg，DSS采用中間值2.5%的濃度，現(xiàn)就造模方法及結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1? 主要試劑

AOM（美國Sigma公司，產(chǎn)品型號：A5486-25MG）;葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt， DSS）（上海甑準生物科技有限公司，產(chǎn)品型號：ZZR-0216011

080）;無菌用水﹑0.9%生理鹽水、蘇木精染液、10%中性福爾馬林固定液均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2? 主要設備

電子秤（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號：FA1004）;低溫超速離心機（上海力申科學儀器有限公司，型號：Neofuge 23R）;石蠟切片機（德國萊卡公司，型號：RM2235）;病理組織烘烤儀（泰維科技，型號：TK-218）;顯微鏡及攝像系統(tǒng)（OLYMPUS公司，型號：BX41）;鑷子、剪刀、注射器、手套、棉簽、離心管由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤中心實驗室提供。

1.3? 實驗小鼠

C57BL/6雄性小鼠，60只，6周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物合格證編號：43004700041870，實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2015-0008）。

1.4? 飼養(yǎng)環(huán)境

飼養(yǎng)室保持良好通風，控制環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度40%～60%，12 h循環(huán)光照，高脂顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，實驗室適應性飼養(yǎng)1周后，自第2周開始實驗。

2 方法

2.1? 動物分組及造模方法

60只小鼠購置飼養(yǎng)1周后，隨機分為實驗A組，B組和C組，每組20只。A組腹腔注射AOM 12.5 mg/kg，B組腹腔注射AOM 10 mg/kg，C組腹腔注射等量生理鹽水，均1次，隨后A、B兩組分別自由飲用2.5% DSS 5 d，其余時間飲用無菌用水，21 d為1循環(huán)周期，分別循環(huán)3個周期，C組一直飲用無菌用水，均用高脂顆粒飼料喂養(yǎng)。造模結(jié)束，禁食1 d后，將小鼠斷頸處死。

2.2? 模型小鼠指標觀察

2.2.1? 各組小鼠一般體征觀察? 每天觀察小鼠的毛發(fā)、大便量，每周測量小鼠的體質(zhì)量，觀察是否存在血便，記錄小鼠死亡情況。

2.2.2? 組織病理學檢查? 在造模結(jié)束后，禁食1 d，頸錐脫臼法處死小鼠，將小鼠固定在小鼠固定架上，剖開腹腔，從盲腸末端到肛門處取下整段結(jié)直腸，用眼科剪縱向剖開腸管，用無菌生理鹽水清潔腸壁后，肉眼觀察有無瘤體，并在4%的多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，病理切片，HE染色，顯微鏡下確定瘤體性質(zhì)。

2.3? 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果以“x±s”表示，兩樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗，定義檢驗水準a=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組小鼠的一般體征情況

在每個周期的最后一天測量小鼠的體質(zhì)量，并計算第3周期造模成功后小鼠體質(zhì)量與造模前的體質(zhì)量差值，進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示：與C組比較，A組和B組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，其中A組最慢，差異統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.05）。見表1。

在飲用DSS第1周期的第7天，A組和B組小鼠的大便次數(shù)均開始增多變稀，7 d后大便性狀恢復正常，而便次仍然多，兩組均未觀察到明顯血便。第1周期結(jié)束后，兩組小鼠毛發(fā)均有脫落，A組更嚴重。

3.2? 各組小鼠瘤體情況

肉眼觀察，A組可見腫瘤呈息肉狀向腸腔突出，伴淺表潰瘍，為腺癌。B組可見散發(fā)息肉，表面光滑，為腺瘤。實驗小鼠結(jié)直腸可見多個散在結(jié)節(jié)，直徑約0.1～0.5 cm。

與C組比較，A組和B組的腺癌成癌率、腺瘤成瘤率差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。A與B兩組比較，A組腺癌成癌率較高，B組腺瘤成瘤率較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3.3? 各組小鼠生存情況

實驗結(jié)束時，A組小鼠死亡7只，B組死亡4只，C組無死亡。A組死亡率與B組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3.4? 各組小鼠瘤體組織學變化

顯微鏡下觀察，可見腺癌細胞排列紊亂，乳頭內(nèi)間質(zhì)少，見圖1A。而腺瘤細胞排列呈大小不一的管狀結(jié)構(gòu)，腺上皮細胞數(shù)目增多，核細長，呈不同程度的異型性，見圖1B。正常腺體見圖1C。

3.5? 該動物模型在成模過程中的證候演變

注射AOM前小鼠活潑好動，注射藥物后，小鼠精神萎靡，蜷縮活動減少，倦怠乏力，飲用DSS后，小鼠大便次數(shù)增多變稀，毛發(fā)脫落，體重明顯減輕，特別是A組。參照中醫(yī)診斷學[12]，按照中醫(yī)方法學-類比法，注射藥物前小鼠為平和質(zhì)，給予高脂飲食聯(lián)合AOM及DSS后，小鼠為濕熱-痰結(jié)-瘀毒證型。在實驗動物具體表現(xiàn)為：造模第1周期濕熱證：小鼠腹瀉、便次增多，伴有黏液，肛門發(fā)紅;第2周期痰結(jié)證：大便性狀恢復正常，但便次仍多，部分小鼠出現(xiàn)腺瘤;第3周期瘀毒證：大便次數(shù)減少，腺瘤癌變，小鼠體質(zhì)量明顯減輕，為惡病質(zhì)。

4 討論

嚙齒類動物模型是臨床實驗最常用的動物模型，模擬濕熱-痰結(jié)-瘀毒型結(jié)直腸癌發(fā)病機制的動物模型對結(jié)直腸癌中藥新藥的研發(fā)有重要的意義。

據(jù)周鳳等[13]報道，高脂飲食聯(lián)合AOM及DSS誘導法更符合臨床脂代謝異常與腸息肉發(fā)病的密切相關(guān)性。每個周期的第1天給小鼠腹腔注射AOM（10 mg/kg），連續(xù)3周期，并飲用3%DSS水3 d+滅菌水4 d，第4周期后只飲用3%DSS水3 d+滅菌水4 d，重復6個周期，高脂飼料和DSS同步干預。第9個周期所有小鼠均出現(xiàn)腹瀉、稀便，部分小鼠有肉眼血便，不典型增生發(fā)生率為75%。該模型造模周期短，說明高脂飲食可以加重AOM及DSS誘導的小鼠UC及其不典型增生。該方法的缺點為不能模擬腺癌的發(fā)生。另張華月等[14]報道，AOM與DSS聯(lián)合誘導法，第1天腹腔注射AOM（12.5 mg/kg），第6天起連續(xù)5 d飲用2.5%DSS水，21 d為1周期，循環(huán)3周期。第4周小鼠出現(xiàn)急性黏膜炎和畸形腺窩灶，7周出現(xiàn)腺瘤中-重度不典型增生改變，14周出現(xiàn)腺癌。該造模方法較好地模擬人類腸炎向腸癌進展過程，但缺點是造模時間過長。

我們目前需要一種既能較好模擬人類腸炎向腸癌進展過程又周期相對較短的動物模型。徐德魁等[15]報道，高脂飲食后，脂類在消化道代謝過程中產(chǎn)生的一些產(chǎn)物，如次級膽酸、硫化氫等可損害大腸黏膜，破壞腸道內(nèi)微環(huán)境，引起菌群失調(diào)，導致黏膜炎癥。黏膜損傷，腸道細菌可移位到腸黏膜內(nèi)，激發(fā)炎癥反應對結(jié)腸組織進一步破壞。本實驗采用了AOM+DSS誘導造模的優(yōu)點及高脂飲食破壞腸道的特點，用高脂飲食聯(lián)合不同劑量的AOM+2.5% DSS造模，發(fā)現(xiàn)：如果用AOM 10 mg/kg劑量，腺瘤成瘤率較高，本次實驗為68.75%，用AOM 12.5 mg/kg，腺癌發(fā)生率較高，約69.23%，但注射AOM時需嚴格掌握劑量，劑量超過，將直接導致小鼠腸道壞死，小鼠大量死亡。

中醫(yī)認為，大腸癌是在內(nèi)外因素作用下，由濕熱、瘀毒等浸淫腸道所致。濕邪致病具有纏綿難愈的特性，并可嚴重阻滯氣機，濕邪在腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有特殊作用。濕邪阻滯日久，氣血失調(diào)，氣滯可阻津，進而生痰，氣滯痰阻又可礙血運行，出現(xiàn)瘀血，進而痰瘀互結(jié)，遷延難愈，久而成毒，于是菀郁壅遏，化為癌腫。痰結(jié)是由濕熱發(fā)展為瘀毒的中間過程，在此過程中，濕熱可化生為有形之邪——痰，結(jié)直腸癌是由結(jié)直腸腺瘤（痰結(jié)）演變發(fā)展而來，結(jié)直腸腺瘤被認為是重要的結(jié)直腸癌的癌前病變。上述實驗過程顯示，結(jié)直腸癌形成的3個周期可能為濕熱-痰結(jié)-瘀毒。

綜上所述，由高脂飲食聯(lián)合AOM和DSS模擬的炎性結(jié)直腸癌小鼠模型符合中醫(yī)大腸癌濕熱-痰結(jié)-瘀毒的演變過程，AOM 10 mg/kg劑量組適合腺瘤模型，AOM 12.5 mg/kg更適合惡性腫瘤模型，且9周成功造模。本實驗為中醫(yī)藥物研究結(jié)直腸癌提供了相對成熟的模型，對研發(fā)預防和治療結(jié)直腸癌的中藥新藥提供了模型保障，具有一定的科學價值。

參考文獻

[1] 鄭? 樹，張?zhí)K展，黃彥欽.結(jié)直腸癌研究30年回顧和現(xiàn)狀[J].實用腫瘤雜志，2016，31（1）：2-5.

[2] 秦? 文，莊麗維，李? 濱，等.IGF-Ⅰ調(diào)節(jié)血脂異常在結(jié)直腸腺瘤發(fā)生和惡變中的作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013，13（11）：2168-2171.

[3] CORPET D E， PIERRE F. How good are rodent models of carcinogenesis in predicting efficacy in humans？ A systematic review and meta-analysis of colon chemoprevention in rats， mice and men[J]. European Journal of Cancer， 2005， 41（13）： 1911-1922.

[4] 張? 悅，田? 潔，田新宇，等.氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉致腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的建立[J].江蘇大學學報（醫(yī)學版），2015， 1：19-21.

[5] 林凱璇，瞿秀華，趙曉航.AOM/DSS模型與炎癥相關(guān)癌變研究進展[J].生命科學，2012（3）：228-235.

[6] 李文彬.炎癥因子和益生菌在潰瘍性結(jié)腸炎癌變中的作用與相關(guān)機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院，2017.

[7] ANGELOU A， ANDREATOS N， ANTONIOU E， et? al. A novel mod？鄄

ification of the AOM/DSS model for inducing intestinal adenomas in mice[J]. Anticancer Research， 2018， 38（6）： 3467-3470.

[8] PARANG B， BARRETT C W， WILLIAMS C S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer[J]. Methods in Molecular Biology， 2016： 1422：297.

[9] SUZUKI R， KOHNO H， SUGIE S， et al. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice[J]. Carcinogenesis， 2005， 27（1）： 162-169.

[10] KOHNO H， SUZUKI R， CURINI M， et al. Dietary administration with prenyloxycoumarins， auraptene and collinin， inhibits colitis-related colon carcinogenesis in mice[J]. International journal of cancer， 2006， 118（12）： 2936-2942.

[11] BECKER C， FANTINI M C， WIRTZ S， et al. In vivo imaging of colitis and colon cancer development in mice using high resolution chromoendoscopy[J]. Gut， 2005， 54（7）： 950-954.

[12] 朱文峰.中醫(yī)診斷學[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：4-5.

[13] 周? 鳳，劉維新，于艷紅，等.高脂飲食對誘導的小鼠不同周期潰瘍性結(jié)腸炎的影響及白細胞介素的改變[J].中國醫(yī)科大學學報，2017，46（3）：232-237.

[14] 張華月，李? 琦，付曉伶.結(jié)直腸相關(guān)癌前病變動物模型的研究進展[J].中國醫(yī)藥導報，2018，15（5）：27-31，36.

[15] 徐德魁，郎緒龍，于慶功，等.高脂飲食對結(jié)腸炎小鼠腫瘤壞死因子-α表達的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2014，28（11）：1075-1076.

（本文編輯? 蘇? 維）