腰椎間盤突出癥大鼠模型的建立及病理動態(tài)研究

師振予　郭亦杰　曾嶸　郭建生　李鑫

〔摘要〕 目的 建立腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）大鼠模型，對建模后不同時間點模型效果進行動態(tài)比較以期發(fā)現(xiàn)建模后的最佳實驗節(jié)點。方法 將48只Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為對照組（假手術組）、模型組，采用大鼠自體髓核移植法建立LDH大鼠模型。造模術后于不同時間節(jié)點（第7、14、21、28天）觀察動物行為狀態(tài)并隨機處死動物后進行血清學和病理組織學檢查。通過HE染色觀察大鼠神經組織病理學的改變，采用ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。結果 （1）造模術后模型組和對照組（假手術組）大鼠均有明顯的左后肢無力、跛行癥狀。術后第7天開始，對照組癥狀有恢復的趨勢，并于第14天后基本恢復正常;模型組癥狀持續(xù)存在至術后第28天有好轉趨勢。（2）術后第7天對照組（假手術組）神經組織可見出血及炎癥細胞浸潤，但無神經損傷表現(xiàn);模型組除可見出血及炎癥細胞浸潤還有神經受壓表現(xiàn)。術后第14天開始對照組出血及炎癥細胞浸潤明顯好轉并于術后第21天基本恢復正常;而模型組術后第21天仍可見明顯炎癥細胞浸潤、出現(xiàn)粘連及纖維化表現(xiàn)，并于術后第28天出現(xiàn)較明顯的纖維化表現(xiàn)。（3）對照組大鼠TNF-α水平隨時間進行明顯下降。與對照組比較，模型組血清TNF-α水平在術后各個時間節(jié)點均顯著升高（P<0.05）。結論 采用自體髓核移植法能有效地模擬建立LDH模型。造模術后第21天對照組基本恢復正常而模型組行為學表現(xiàn)、病理學檢查及血清TNF-α水平與對照組比較均有明顯差異，而在術后第21天之后模型組有恢復的趨勢，說明造模術后第21天是比較合適的實驗時間節(jié)點。

〔關鍵詞〕 腰椎間盤突出癥;大鼠模型;時間節(jié)點;腫瘤壞死因子-α

〔中圖分類號〕R331;R681.5+3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.007

〔Abstract〕 Objective To establish a rat model of lumbar disc herniation （LDH） and dynamically compare the effects of the models at different time points after modeling in order to find the best experimental node after modeling. Methods A total of 48 Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into a control group （a sham operation group） and a model group. LDH rat model was established by autologous nucleus pulposus transplantation in rats. After modeling， the behavioral status of the animals was observed at different time points （days 7， 14， 21， and 28）， and the animals were randomly sacrificed for serological and pathological examination. The pathological changes of the nerve tissue in rats were observed by HE staining， and the serum tumor necrosis factor-α （TNF-α） levels were measured by ELISA. Results （1） After modeling， the rats in the model group and the control group （the sham operation group） had obvious symptoms of weakness and lameness in the left hind limb. Starting from the 7th day after surgery， the symptoms in the control group showed a tendency to recover， and basically returned to normal after the 14th day. The symptoms in the model group continued to persist until the 28th day after surgery. （2） In the control group （the sham operation group）， bleeding and inflammatory cell infiltration were seen in the control group （the sham operation group） on the 7th day after the operation， but no nerve damage was observed; in the model group， in addition to bleeding and inflammatory cell infiltration， there was nerve compression. On the 14th day after the operation， bleeding and inflammatory cell infiltration in the control group improved significantly and returned to normal on the 21st day after operation; while in the model group， obvious inflammatory cell infiltration， adhesion and fibrosis appeared on the 21st day after operation. On the 28th day after surgery， more obvious fibrosis appeared. （3） Serum TNF-α in the control group decreased significantly over time. Compared with the control group， serum TNF-α level of model group was significantly increased on each time points after modeling （P<0.05）. Conclusion The adoption of autologous nucleus pulposus transplantation can effectively simulate the establishment of LDH model. The control group returned to normal on the 21st day after modeling， and the behavioral performance， pathological examination， and serum TNF-α levels of the model group were significantly different from those of the control group. However， the model group recovered after 21st day， the trend indicates that the 21st day after modeling is a more appropriate experimental time point.

〔Keywords〕 lumbar disc herniation; rat model; time point; tumor necrosis factor-α

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是一種發(fā)病率高且嚴重影響中老年人健康和生活質量的疾病[1]，目前本病發(fā)生發(fā)展的生物學機制尚不明確。要探討治療LDH藥物的作用和作用機制，復制與選擇與臨床相符合的動物模型至關重要。由于人類LDH主要是自發(fā)性疾病，是長期受到應力損傷或由于椎間盤退化，椎間盤細胞內環(huán)境變化后所逐漸發(fā)展起來的[2]。因此，運用損傷性方法建立動物模型來探討治療LDH藥物療效與機制的研究在過去十余年中并未取得十分突出的進展。不過由于要獲得人類退化的椎間盤組織十分困難，同時在體外研究中也幾乎不可能獲得正常的人類椎間盤組織作為對照，因此，盡管存在一些限制，動物模型系統(tǒng)仍然是研究

LDH不可或缺的途徑。本實驗研究旨在建立一種合適的LDH動物模型，并對建模后不同時間點模型效果進行動態(tài)比較，以期發(fā)現(xiàn)建模后的最佳實驗節(jié)點。

1 材料

1.1? 動物

SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量（200±20）g，雌雄兼用，共48只。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗動物許可證號SCXK（湘）2009-0004。動物合格證號：HNSSLKJ20111549。

1.2? 試劑

10%水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司，批號：20110303）;腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（深圳雷杜生命科學股份有限公司，批號：201103）;注射用青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠，批號：A100809310）。

1.3? 儀器

SL系列手術放大鏡（SLE2542，蘇州捷美醫(yī)療器械有限公司）;MP5001電子天平（上海舜宇恒平有限公司）;LG10-2.4A高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）;RT-6000酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）;LEICA DMLB2雙目顯微鏡（德國LEICA公司）;Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司）;Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）。

2 方法

2.1? 動物分組與模型建立

48只大鼠隨機分為對照組（假手術組）及模型組，每組24只，雌雄各半。將模型組大鼠術前12 h禁食、不禁水，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，于尾根部距肛門約1 cm 處切斷鼠尾并縫合傷口。在切斷鼠尾前用橡皮條結扎切口的近端以減少出血。無菌條件下于背部正中切開皮膚（長約4 cm）、皮下組織，從左側棘突上鈍性分離椎旁肌，以雙側髂棘為定位點，切除髂棘以上兩個椎體的棘突、左側椎板和關節(jié)突。在手術顯微鏡下暴露左側的硬脊膜，確認出左側脊神經，取切下的鼠尾部的呈膠凍樣椎間盤髓核5個（約10 mg）輕放于左側神經根背側周圍，仔細止血后逐層關閉切口，術后再次用碘酒和75%酒精消毒皮膚并單籠喂養(yǎng)12 h后放回原籠。對照組（假手術組）僅切斷鼠尾，分離椎旁肌，切除髂棘以上兩個椎體的棘突、左側椎板和關節(jié)突。大鼠術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉2×105 U/kg，每天1次。

2.2? 標本采集

術后分別于第7、14、21、28天隨機處死1/4動物（每次每組6只，雌雄各半），斷頭取血，在3 000 r/min速度下離心15 min，吸取上清備用。同時取神經節(jié)、神經根和脊椎組織，4%中性甲醛固定，5%硝酸脫鈣后對神經節(jié)、神經根和脊椎組織按縱和橫2個面進行修塊。

2.3? 大鼠行為學觀察

采用Siegal T[3]推薦的神經功能判斷六級分法（見表1），分別于造模術后第3、7、14、21、28天觀察，每天2次。采用神經功能分值進行統(tǒng)計分析（t檢驗），0級-2分，1級-4分，2級-6分，3級-8分，4級-10分，5級-12分。

2.4? 神經節(jié)、神經根和脊椎組織病理學檢查

將標本浸入10%中性福爾馬林固定液中固定48 h，各級酒精梯度脫水，石蠟包埋，石蠟切片機上切成4 μm石蠟切片，將切片置于58 ℃烤箱中烘烤18 h，行HE染色，用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)觀察并攝影記錄結果。

2.5? ELISA法測定血清TNF-α含量

嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定兩組大鼠血清TNF-α含量：用RT-6000酶標儀于450 nm波長測定血清樣本吸光度值，根據標準品濃度及對應的吸光度值，計算標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的吸光度值，在回歸方程上計算出對應的血清TNF-α含量。

2.6? 統(tǒng)計學處理

所有數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，計數資料采用秩和檢驗，計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗及方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 行為學觀察

麻醉蘇醒后兩組大鼠均有蜷縮，少動的表現(xiàn)，但無癱瘓鼠。術后第3天，兩組均有明顯癥狀，神經功能評分均在3級以上;術后第7天，對照組有恢復的趨勢，模型組仍有明顯癥狀;術后第14天，對照組明顯好轉，模型組稍有好轉;術后第21天，對照組基本恢復正常而模型組癥狀持續(xù);術后第28天，對照組恢復正常，模型組癥狀好轉。術后第7天開始，與對照組比較，模型組神經功能分值在各個時間節(jié)點均顯著升高（P<0.05）。見表2。

3.2? 神經及神經節(jié)病理學改變

造模術后第7天，對照組（假手術組）神經節(jié)及神經根周圍小血管擴張充血，神經組織內可見小靜脈擴張充血，神經組織水腫，炎性細胞浸潤，但未見神經束受壓表現(xiàn)。模型組可見出血及炎癥細胞細胞浸潤，同時有神經受壓表現(xiàn)。見圖1。

造模術后第14天時，對照組出血及炎癥細胞細胞浸潤明顯好轉，神經元輕度水腫;模型組顯示較明顯的炎性細胞浸潤，浸潤的炎性細胞以中性粒細胞、巨噬細胞為主。神經組織腫脹明顯、神經髓鞘腫脹、碎裂，軸突腫脹或消失，許旺氏細胞自溶、軟化。見圖2。

造模術后第21天，對照組炎癥細胞細胞浸潤明顯好轉及其他炎癥表現(xiàn)基本恢復正常，模型組仍顯示較明顯的炎性細胞浸潤。同時出現(xiàn)有成纖維細胞浸潤，神經部分纖維化表現(xiàn)。見圖3。

造模術后第28天，對照組炎癥細胞細胞浸潤明顯好轉及其他炎癥表現(xiàn)基本恢復正常，模型組炎癥細胞細胞浸潤減弱，受壓神經纖維組織及周圍組織明顯增生，神經纖維組織內有肉芽組織形成纖維間隙縮小，輕度瘢痕化，受壓神經表現(xiàn)出明顯的纖維化。見圖4。

3.3? 大鼠血清TNF-α表達的變化

對照組大鼠TNF-α表達隨時間進行明顯下降。造模術后第7天開始模型組血清中TNF-α含量高于對照組。術后第14天開始，與對照組比較，模型組血清中TNF-α含量在各個時間節(jié)點均顯著升高（P<0.05）。結果見表3。

4 討論

研究表明，多種大、小動物椎間盤的解剖學和生物力學特點都基本與人類相似，并可采取合適的模式模擬人類椎間盤退化的過程[4-5]。大小動物在構建模型上各有優(yōu)缺點，Beckstein J C[6]詳細比較了7種哺乳動物牛、豬、狒狒、羊、兔、大鼠和小鼠通過壓縮椎間盤造模后出現(xiàn)的椎間盤軸向力學變化以及椎間盤中蛋白多糖含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)不同動物的力學參數變化往往并沒有出現(xiàn)顯著差異，同時椎間盤中蛋白多糖和水含量的變化也表現(xiàn)出相似性，但不同物種出現(xiàn)退變所需的時間有顯著差異。因此，相較于大動物難以飼養(yǎng)且昂貴等缺點，小動物造模雖然觀察和取材較困難，但仍具有一定的優(yōu)勢。

常用的LDH模方法主要有自發(fā)性模型和誘發(fā)性模型兩類。使用自發(fā)性椎間盤突出動物模型實驗周期長、動物種類少，且難以確切估計模型成功時間，故較少應用。目前主要使用的模型仍是誘發(fā)性模型，例如從神經根受到慢性壓迫的角度進行造模研究。此種造模方法能比較好地再現(xiàn)椎間盤突出癥引起神經壓迫癥狀的過程，特別是隨著椎間盤突出癥發(fā)病機制中自身免疫學說研究的深入，自體髓核移植法造模逐漸成為目前主流的造模方法。自體髓核移植法的基本思路是將實驗動物自身的髓核取出，通過注射或手術等法將其移植至脊神經根和硬脊膜之間，從而模擬出LDH所致的癥狀。該法與LDH的病理生理機制基本吻合，目前廣泛應用于LDH的發(fā)病機制以及神經遞質和炎癥因子甚至是一些藥物和治療手段作用機制的研究中[7]。越來越多的研究表明，自身免疫的異常在椎間盤突出癥所致的常見癥狀如腰痛和下肢根性神經痛發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用[8-9]，故采取自體髓核移植法能較好地模擬椎間盤突出癥的病理生理機制。

自身免疫反應活化過程包括抗原捕獲、原型輔助性T（Th）細胞的活化和最終自身抗體的產生。其中Th細胞的活化是自身免疫系統(tǒng)激活過程中十分重要的途徑，原型Th細胞活化后主要分化為產生干擾素-γ（IFN-γ）為主Th-1（I型輔助T細胞）細胞和產生白細胞介素-4（IL-4）為主的Th-2（II型輔助T細胞）細胞，Geiss A等[10]在對自體髓核引起免疫反應的研究中發(fā)現(xiàn)，在豬自體髓核突出模型中自體髓核“接觸”免疫系統(tǒng)3周后能夠促使原型Th細胞主要轉變?yōu)楫a生IL-4為主的Th-2型細胞。IL-4是十分重要的細胞因子，能促使B淋巴細胞活化并上調II型主要組織兼容性復合體（majorhistocompatibility complexII，MHC II）的表達[11]，同時IL-4也能促使巨噬細胞轉換為修復型巨噬細胞（M2細胞）從而促進與創(chuàng)面修復和纖維化，此項研究提示自體髓核在暴露于免疫系統(tǒng)后能促使免疫反應的發(fā)生從而誘發(fā)炎癥反應。同時研究也發(fā)現(xiàn)在豬皮下植入含自體髓核的鈦囊后，與空白組相比含自體髓核的鈦囊中活化T細胞（CD4和CD8）比例明顯較高，表達免疫球蛋白的活化B細胞也明顯增高，該研究提示自體髓核能促進T、B細胞的活化[12]。李暉等[13]研究也證實破碎型LDH標本中有T淋巴細胞浸潤和免疫球蛋白IgG、IgM沉積，因而其病理機制可能是在損傷基礎上的自免疫炎癥反應過程，而完整型腰椎間盤突出以髓核退變、軟骨基質及纖維環(huán)增生為主要表現(xiàn)，但沒有發(fā)現(xiàn)免疫應答反應。

因此，本研究采用比較成熟的自體髓核移植法構建模型，在手術顯微鏡下成功將從鼠尾部取出的自體髓核移植至脊神經根和硬脊膜之間，成功建立了LDH模型。在造模術后第3天對照組（假手術組）與模型組均有明顯癥狀，但術后第7天開始假手術組逐漸恢復而模型組仍有明顯癥狀并直至術后第21天仍有明顯癥狀;病理檢查也顯示在植入髓核后對照組與模型組的病理結果有顯著性差異，病理學和行為學觀察結果均支持模型效果。同時，多項研究已證實TNF-α是髓核突出后引起炎癥反應的標志性因子，且與炎癥反應所致疼痛密切相關[14-15]。能直接抑制TNF-α的藥物Etanercep已開始應用于臨床治療椎間盤突出癥所致癥狀[16]，Horii M等[17]發(fā)現(xiàn)，在直接穿刺損傷大鼠椎間盤后即可出現(xiàn)大鼠背根神經節(jié)中降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide， CGRP）的表達增高，而Etanercep能迅速下調CGRP的表達，此途徑可能是Etanercep的治療機制。因此，我們選取測定血清中TNF-α的表達來驗證模型的效果，結果顯示，對照組TNF-α的表達隨時間進行明顯下降而模型組未見此種趨勢，模型組TNF-α的表達在各個時間節(jié)點均顯著高于對照組，說明通過移植自體髓核造模后成功誘導出了自身免疫性炎癥反應。

炎性介質、細胞因子既是髓核退變、椎間盤突出后的病理產物，又是進一步促進退變、導致臨床癥狀的致病因素。從細胞和分子水平，從細胞因子、炎癥介質表達、自身免疫調節(jié)等多角度對藥物治療椎間盤突出癥的有效性和作用機制進行深入細致的探討對豐富傳統(tǒng)中藥治療LDH的科學依據具有重要的意義。為了獲得最佳實驗效果，我們在此次模型研究中設計了對不同時間點模型效果的動態(tài)觀察，以期獲得建模后的最佳實驗時間點。結果顯示，在造模術后第21天對照組行為學癥狀和病理檢查基本恢復正常而模型組在行為學表現(xiàn)、病理學檢查及血清TNF-α表達上與對照組比較均有較大差異;而此后模型組開始有恢復的趨勢。目前國內尚未見此類模型效果研究，Souza等[18]在自體髓核誘導的炎癥細胞因子表達和痛覺閾值與時間相關性的研究中發(fā)現(xiàn)，自體髓核移植后表達水平最高的細胞因子是TNF-α、IL-1β和細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子-1（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）且炎癥因子表達水平和痛閾與植入時間呈正相關：植入7 d后大鼠細胞因子表達水平及痛閾值與對照組基本相當，但植入21 d細胞因子表達水平及痛閾值及顯著高于對照組。我們的研究結果與其相似。綜上所述，選取造模術后第21天作為LDH模型觀察時間可能是比較藥物療效及機制比較合適的實驗時間節(jié)點。

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（本文編輯? 楊? 瑛）