黃芪甲苷抗二甲基亞硝胺誘導肝纖維化大鼠效應研究

白雪　陸璐　劉振權　邊艷琴

〔摘要〕 目的 探討黃芪甲苷對二甲基亞硝胺（Dimethylnitrosamine， DMN）誘導肝纖維化大鼠模型的作用。方法 選取27只雄性Wistar大鼠，隨機分為正常組、模型組和黃芪甲苷組。模型組和黃芪甲苷組大鼠，采用腹腔注射DMN誘導肝纖維化模型，持續(xù)4周。于造模第3周開始，黃芪甲苷組在繼續(xù)造模的同時予以黃芪甲苷干預，正常組和模型組給于等容量蒸餾水灌胃。4周末（即藥物干預兩周）處死全部大鼠，觀察各組大鼠一般情況、肝組織病理學;檢測各組大鼠血清肝功能水平、肝組織中羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量;免疫組化法檢測肝組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達情況。結果 與正常組比較，模型組肝臟明顯縮小，組織炎細胞浸潤增加，膠原沉積明顯增多，肝功能指標明顯異常（P<0.01），提示纖維化形成。與模型組比較，黃芪甲苷可以顯著改善肝臟病理，減輕肝臟膠原沉積及肝臟Hyp含量，降低血清ALT、AST、GGT水平及TBil含量，升高ALB含量，顯著抑制肝組織α-SMA蛋白表達（P<0.05或P<0.01）。結論 黃芪甲苷具有顯著保肝降酶抗肝纖維化形成作用，其機制可能跟抑制肝星狀細胞的活化相關。

〔關鍵詞〕 肝纖維化;二甲基亞硝胺;黃芪甲苷;效應評價

〔中圖分類號〕R285.5;R575? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of astragaloside IV on dimethylnitrosamine （DMN）-induced hepatic fibrosis in rats. Methods A total of 27 male Wistar rats were selected and randomly divided into a normal group， a model group and an astragaloside IV group. Rats in the model group and astragaloside IV group were induced by intraperitoneal injection of DMN for 4 weeks. From the 3rd week of modeling， the astragaloside IV group was treated with astragaloside IV while the modeling was continued. The normal group and the model group were given the same amount of distilled water. At the end of 4 weeks （2 weeks of drug intervention）， rats were sacrificed and samples of each group were observed for the general situation， liver histopathology; serum liver function level and hydroxyproline （Hyp） content in liver tissue of each group of rats were detected. The expression of a-SMA protein in liver tissue was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the liver of the model group was significantly reduced. Tissue inflammation cell infiltration increased. The collagen deposition in the model group increased significantly. Liver function indicators were significantly abnormal（P<0.01）. These suggested the formation of fibrosis. Compared with the model group， astragaloside IV can significantly improve liver pathology， alleviate liver collagen deposition and liver hydroxyproline content， reduce serum levels of ALT， AST， GGT and TBi contents， increase ALB content， significantly inhibit the expression of α-SMA protein in liver tissue （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Astragaloside IV has significant effects of protecting liver and reducing enzymes on liver fibrosis， and the mechanism may be related to inhibiting the activation of hepatic stellate cells.

〔Keywords〕 hepatic fibrosis; dimethylnitrosamine; astragaloside IV; effect evaluation

肝纖維化是各種慢性肝病引起的細胞外基質的過度增生和沉積，是一種組織損傷愈合反應。肝纖維化進一步發(fā)展將導致肝硬化甚至肝癌發(fā)生。肝硬化目前仍是我國常見疾病和主要死亡病因之一，也是影響我國人民健康及社會發(fā)展的重大、疑難疾病。目前尚無特效的FDA批準的抗肝纖維化的化學或生物藥物進入臨床應用。

黃芪湯出自《太平惠民和劑局方》，由黃芪六兩、炙甘草一兩、大棗一枚組成，治“諸虛不足，肢體勞倦，心中煩悸，唇口干渴，食少面黃，或先渴而欲發(fā)瘡癤，或病癰疽而后渴者”，臨床常用其加減配伍治療各種虛損不足之證?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪湯可顯著改善肝纖維動物模型膠原沉積，抑制肝星狀細胞活化、減少上皮間質細胞轉分化過程，具有顯著地抗肝纖維化作用[1-5]。然而，其起效的物質基礎，目前尚不清楚。黃芪甲苷即黃芪苷IV，是黃芪的主要有效成分之一，具有顯著地抗細胞氧化損傷[6-8]、抗細胞凋亡[9]等作用。黃芪甲苷在慢性腎病[10-11]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12]、心肌梗死[13]、慢性萎縮性胃炎[14]等多種疾病模型中均有研究報道，但在肝纖維化研究中報道較少。本研究通過復制經(jīng)典的二甲基亞硝胺（Dimethylnitrosamine， DMN）誘導肝纖維化動物模型，來研究黃芪甲苷抗肝纖維化療效機制，為進一步闡明黃芪湯抗肝纖維化的療效物質基礎提供實驗支持。

1 材料

1.1? 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠27只，體質量（190±15） g，購自中國科學院上海實驗動物中心。動物許可證號：SCXK（滬）2008-0003。上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)、造模和觀察，自由飲食水。

1.2? 藥物

黃芪甲苷，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，質量分數(shù)大于98%;使用時用蒸餾水溶解稀釋成混懸液。

1.3? 主要試劑及設備

DMN購自日本和光純藥工業(yè)株式會社，貨號：KWM6890;羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）標準品購自日本Nakateitesuku Corporation，貨號：MIR8282;血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷氨酰轉酞酶（r-GT）、白蛋白（ALB）、血清總膽紅素（TBil）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;石蠟購自德國Leica;蘇木精、伊紅染料均購自南京建成生物工程研究所;天狼星紅（Sirus Red，SR）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體均購自sigma公司;二甲苯、甲醛、甲醇、無水乙醇等化學試劑均購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;HRP標記的羊抗兔IgG、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;ASP300自動脫水機、EG1160石蠟包埋機、RM2035輪轉切片機、HI1210恒溫水浴、HI1220烤片機，均購自德國Leica公司。

2 方法

2.1? 動物分組、造模及干預

27只Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量分層隨機分為正常組、模型組、黃芪甲苷組，每組9只。造模方法：參照Ala-Kokko[15]方法，以2 mL/kg劑量腹腔注射0.5%的DMN溶液（以生理鹽水稀釋），每周連續(xù)3 d，共持續(xù)4周，正常對照組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。從造模第3周開始，黃芪甲苷組在繼續(xù)造模同時給予黃芪甲苷10 mg/kg灌胃治療（給藥劑量參照臨床黃芪常用量及課題組前期研究結果[1]，使用前用蒸餾水溶解稀釋成混懸液），每日1次，共2周。正常與模型組大鼠以同等體積蒸餾水灌胃。

2.2? 檢測指標及方法

2.2.1? 各組大鼠一般情況? 每天觀測各組大鼠活動狀態(tài)，并記錄大鼠體質量變化情況。實驗結束后記錄各組大鼠的體質量、肝質量、脾質量、肝體比、脾體比、腹水及死亡率等。

2.2.2? 肝功能檢測? 檢測血清中ALT、AST、GGT活性和ALB和TBil含量。檢測程序及方法按照試劑盒說明書進行。

2.2.3? 肝組織Hyp含量測定? 參照Jamall法[16]測定肝組織Hyp含量。各標本切取濕肝約100 mg，冰鹽水沖洗，濾紙吸凈水分后，置于預先裝有蒸餾水2.5 mL，12 mol/L鹽酸2.5 mL安培瓶中，火烤封瓶;然后將安培瓶置于105 ℃烘箱水解18 h;水解結束，待冷卻后，濾紙過濾水解液，每個標本取100 μL的水解液置于5 mL玻璃試管中，置于40 ℃烘箱干燥。干燥后樣品+50%異丙醇1.2 mL+0.56%氯氨-T工作液200 μL混勻，室溫放置10 min，加ER溶液1 000 μL，混勻，50 ℃水浴90 min，558 nm比色待測。

2.2.4? HE染色觀測大鼠肝組織炎癥情況? 從肝臟最厚一葉切取1.0 cm×1.0 cm大小肝組織1塊，切成0.5 cm3大小，10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋切片，5 μm厚切片，經(jīng)蘇木精和伊紅染色、中性樹膠封片。光學顯微鏡觀測各組大鼠肝組織炎癥情況。

2.2.5? SR染色觀測大鼠肝組織膠原增生情況? 肝組織經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋切片之后，經(jīng)SR染色、中性樹膠封片。光學顯微鏡觀測各組大鼠肝組織膠原增生情況。膠原纖維增生程度分期標準參照Scheuer P J分期方法[17]。

2.2.6? 免疫組化檢測? 石蠟切片，脫蠟預處理后，用3% H2O2室溫避光孵育10 min滅活內源性酶，洗滌、封閉、一抗室溫孵育30 min后，PBS洗滌3次去除多余一抗，滴加顯色底物溶液，再次室溫孵育30 min后，洗掉多余底物溶液，滴加DAB顯示溶液，然后室溫孵育，光鏡下控制顯色過程;最后蒸餾水洗滌、蘇木素復染、酒精脫水，二甲苯透片，晾干，封片。然后鏡下讀片，拍照，統(tǒng)計分析。

2.3? 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以ANOVA程序進行單因素方差分析、q檢驗，并用LSD進行兩兩比較，等級資料采用Ridit分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 一般情況

各組大鼠實驗中體質量變化情況見圖1。如圖所示，隨著造模時間的延長，模型組大鼠體質量增長呈曲線上升趨勢;與正常組比較，模型組大鼠體質量明顯增長緩慢且低于正常組;與模型組比較，黃芪甲苷組體質量增長明顯高于模型組大鼠。殺鼠取材后的實體標本顯示（見圖2），正常組大鼠肝臟組織光滑柔軟，脾臟組織正常;與正常組比較，模型組大鼠肝臟明顯縮小且變硬，組織無光澤，脾臟增大;與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠肝組織增大且變柔軟有光澤，脾臟較模型組增大。各組大鼠體質量、肝質量、脾質量、肝體比、脾體比情況見圖3。如圖3所示，與正常組比較，模型組肝體比顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，黃芪甲苷組可以顯著提高肝體比值（P<0.01），結果與實體標本（如圖2）觀測到結果一致。與模型組比較，黃芪甲苷組腹水發(fā)生率明顯偏低（見圖4）;各組大鼠均無死亡發(fā)生。

3.2? 肝組織病理及膠原增生情況

HE染色結果顯示，模型組大鼠肝臟組織大量的炎細胞浸潤，肝細胞腫脹，伴隨小葉中心出血及片狀壞死，間質纖維組織大量增生，小葉結構被破壞。與模型組比較，黃芪甲苷組炎細胞浸潤明顯減少，肝細胞腫脹明顯減輕，小葉出血及壞死均減輕，結構相對完整，提示黃芪甲苷有顯著地抗炎作用。見圖5。

SR染色與正常組比較，模型組增生的纖維組織明顯增多，肝小葉結構完全被破壞，彌漫性增生的粗大膠原纖維將肝小葉包饒形成假小葉。與模型組比較，黃芪甲苷組肝組織纖維增生顯著減輕，增生的纖維組織形成不連續(xù)的纖維間隔，且間隔較模型組明顯變窄，提示黃芪甲苷可顯著抑制肝臟膠原的生成。見圖5。

3.3? 生化檢測

與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、GGT活性和TBil含量顯著升高（P<0.01），分別是正常組的3.61、1.83、1.97、2.01倍;血清ALB含量顯著降低（P<0.01），是正常組大鼠的74.7%。與模型組相比，黃芪甲苷組可顯著降低血清ALT、AST、GGT活性和TBil含量（P<0.05或P<0.01），提高ALB含量（P<0.05），具有顯著地保肝降酶作用。見圖6。

3.4? 肝組織Hyp含量的變化與膠原沉積變化

如表1結果所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量顯著增加，是正常組大鼠的2.35倍，膠原增生分期主要集中在Ⅲ、Ⅳ期，提示造模成功;與模型組比較，黃芪甲苷組顯著降低了肝組織Hyp含量，膠原增生分期明顯降低一個等級，主要集中在Ⅱ、Ⅲ期，這與肝臟SR染色結果基本一致。

3.5? 肝組織α-SMA蛋白表達

正常組大鼠只有在匯管區(qū)周圍有少量的α-SMA蛋白表達;模型組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達增加。見圖7。

4 討論

黃芪的主要化學成分有黃酮類、皂苷類、黃芪多糖、生物堿、葡萄糖醛酸及多種微量元素等[18]。黃芪甲苷屬于皂苷類化合物，是黃芪的主要活性成分。本研究結果顯示，黃芪甲苷可以顯著抑制DMN誘導肝纖維化大鼠的肝臟炎癥反應，降低肝臟膠原沉積及肝臟ALT、AST、GGT活性和TBil含量，升高ALB含量，抑制肝組織α-SMA蛋白表達，具有顯著地保肝降酶抗肝纖維化作用。

DMN誘導肝纖維化大鼠模型是研究肝纖維化的經(jīng)典動物模型，因其肝組織膠原沉積特征與人類肝纖維化病理組織特征非常相似，且成模時間短，染毒后不易恢復等特征，成為大家研究肝纖維化的首選動物模型之一。Hyp是膠原組織中特有的氨基酸，約占膠原氨基酸總量的13%。通過檢測肝組織中Hyp含量，可以間接反應肝組織中膠原組織的表達水平，提示組織中纖維化水平。本研究通過復制經(jīng)典DMN誘導的肝纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以顯著改善DMN誘導大鼠肝組織炎癥反應及膠原纖維增生，可以顯著降低肝組織Hyp含量，提示黃芪甲苷可以顯著抑制DMN誘導肝纖維大鼠肝臟組織膠原的沉積，減輕肝臟炎癥反應，進而改善肝臟功能。

α-SMA蛋白被認為是肌成纖維細胞的標志物。眾所周知，靜止期的肝星狀細胞（hepatic stellate cell， HSC）不表達α-SMA，當HSC受到各種致纖維化因素刺激活化后，轉化為肌成纖維細胞，高表達α-SMA，并分泌大量膠原蛋白沉積在細胞外基質中。因此，α-SMA的表達部位常常與膠原沉積位置一致，不僅可以反映HSC活化情況，也可以間接表征纖維化發(fā)生的情況，是研究肝纖維化發(fā)生與否的重要指標。本研究結果顯示，黃芪甲苷可顯著抑制DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織α-SMA蛋白，提示黃芪甲苷具有明顯的抗肝纖維化作用，其作用機制可能跟抑制HSC細胞活化相關。

黃芪甲苷作為黃芪的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著地抗氧化作用[19]，可以顯著減少丙二醛（MDA）、過氧化物酶（MPO）、炎性細胞因子水平，增加超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GHS-Px）等水平;可通過上調Wnt/β-catenin[20]，可阻斷TGF-β/Smad[21]通路下調轉化生長因子（TGF）-β1表達，從而減弱腎臟纖維化的發(fā)生;它也可以通過抑制MAPK和NF-κB通路，抑制TGFβ1誘導的腎臟成纖維化過程[22]，提示黃芪甲苷具有明顯的抗炎抗纖維化作用，但大多數(shù)的研究主要集中在肺纖維化、腎臟纖維化和心肌纖維化[23]，而對肝臟纖維化的研究報道很少。本研究結果從整體動物實驗出發(fā)，借用經(jīng)典肝纖維化動物模型研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可抑制肝臟炎癥及膠原增生，具有顯著地抗肝纖維化作用，其機制可能跟抑制HSC細胞的活化相關。本研究將為黃芪甲苷臨床用于抗纖維化，尤其是肝纖維化治療提供數(shù)據(jù)支持。然而，本研究結果僅對黃芪甲苷抗肝纖維化的療效做了初步探索，深入的抗肝纖維化機制仍需進一步研究。

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（本文編輯? 楊? 瑛）