益腎通癃膠囊對(duì)前列腺增生模型大鼠雌雄激素比及缺氧誘導(dǎo)因子-1α的影響

涂雅玲　陳其華

〔摘要〕 目的 探討益腎通癃膠囊對(duì)前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）模型大鼠雌雄激素比及缺氧誘導(dǎo)因子1α（chypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的影響。方法 對(duì)SD雄性大鼠皮下注射丙酸睪酮5 mg/（kg·d），連續(xù)4周。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、中藥對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組7只。實(shí)驗(yàn)組大鼠灌服0.365 g/kg益腎通癃膠囊混懸液;中藥對(duì)照組灌服0.183 g/kg癃閉舒膠囊混懸液;正常組及模型組給予同等容量的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8周后，光鏡下觀察前列腺組織病理學(xué)變化;稱(chēng)取前列腺濕重并計(jì)算前列腺指數(shù);檢測(cè)大鼠血清E2、T、DHT水平及E2/T;測(cè)定前列腺組織中HIF-1α蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺腺體輕微增生，少數(shù)呈乳頭狀增生，腺腔基本恢復(fù)正常。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺體積、前列腺濕重、前列腺指數(shù)及前列腺組織中的HIF-1α蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.01）;大鼠血清中的DHT、E2、T水平降低，E2/T比值升高（P<0.01）。結(jié)論 益腎通癃膠囊可能通過(guò)降低BPH模型大鼠血清中的DHT、E2、T水平，升高E2/T比值，抑制HIF-1α的表達(dá)起治療BPH的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 前列腺增生;益腎通癃膠囊;雌雄激素比;缺氧誘導(dǎo)因子

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Yishen Tongzhi Capsules on the estrogen and androgen ratio in rat model of benign prostatic hyperplasia and the effects on hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）. Methods SD male rats were injected subcutaneously with testosterone propionate 5 mg/（kg·d） for 4 weeks. After successful modeling， the rats were randomly divided into 4 groups： a normal group， a model group， a Chinese medicine control group and an experimental group， with 7 rats in each group. Rats in the experimental group were administrated with 0.365 g/kg Yishen Tonglong Capsules Suspension; the Chinese medicine control group was administrated with 0.183 g/kg Longbishu Capsules Suspension; the normal group and the model group were given the same volume of saline. After 8 weeks of continuous intragastric administration， the histopathological changes of prostate were observed under light microscope; The prostate wet weight was measured and the prostate index was calculated; The rat serum E2， T， DHT levels， and E2/T were detected; HIF-1α protein expression in prostate tissue was measured. Results Compared with the model group， the prostate glands of the experimental group had a slight hyperplasia， and a few showed papillary hyperplasia. The glandular cavity returned to normal. Compared with the model group， rats in the experimental group had reduced prostate volume， wet prostate weight， prostate index， and HIF-1α protein expression levels in prostate tissue （P<0.01）; DHT， E2， and T levels in rat serum were reduced. E2/T ratio increased （P<0.01）. Conclusion Yishen Tonglong Capsules may treat BPH by reducing the levels of DHT， E2， T in the serum of BPH model rats， increasing the E2/T ratio and inhibiting the expression of HIF-1α.

〔Keywords〕 prostatic hyperplasia; Yishen Tonglong Capsules; estrogen and androgen ratio; hypoxia-inducible factor

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性常見(jiàn)疾病之一[1]，是以排尿不暢、夜尿增多、尿頻、排尿費(fèi)力、尿線(xiàn)中斷為主要臨床癥狀的一種疾病，屬中醫(yī)學(xué)“精癃”范疇[2]。該病的發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增高，50歲以上發(fā)病率大于50%，80歲以上發(fā)病率達(dá)83%，關(guān)于BPH的病因和發(fā)病機(jī)制的研究頗多，主要有雌雄激素協(xié)同學(xué)說(shuō)、生長(zhǎng)因子學(xué)說(shuō)以及細(xì)胞凋亡與基因調(diào)控學(xué)說(shuō)等，但至今其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)大鼠前列腺組織及血清中缺氧誘導(dǎo)因子1α（chypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）水平與BPH發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)[5]。筆者導(dǎo)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制了治療BPH療效較好的益腎通癃膠囊[6]，本研究通過(guò)觀察益腎通癃膠囊對(duì)雌雄激素比及HIF-1α表達(dá)的影響，以深入探討益腎通癃膠囊治療BPH的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，8周齡。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

1.2? 藥品與試劑

益腎通癃膠囊，規(guī)格為0.4 g/粒，人用量為6粒/次，2次/d，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供。癃閉舒膠囊，規(guī)格：0.3 g/粒，人用量為3粒/次，2次/d，石家莊科迪藥業(yè)有限公司。丙酸睪酮注射液：25 mg/mL，天津金耀藥業(yè)有限公司。睪酮（T）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)CSB-E05100r）、大鼠雌二醇（E2）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)CSB-E05110r）、大鼠雙氫睪酮（DHT）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)CSB-E07879r）均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。抗β-肌動(dòng)蛋白抗體（貨號(hào)bs-0061R）、缺氧誘導(dǎo)因子1α/低氧誘導(dǎo)因子-1抗體（貨號(hào)bs-0737R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3? 主要儀器

酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan Sky，賽默飛世爾科技公司）;離心機(jī)（型號(hào)：SCILOGEX CF1524R，美國(guó)賽洛捷克公司）;電子天平（型號(hào)：Scout STX，武漢集思儀器設(shè)備有限公司）;電泳儀（型號(hào)：DYCZ-40K，北京六一生物技術(shù)有限公司）。

1.4? 造模與給藥[7-8]

36只健康雄性SD大鼠，8周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)取11只作為正常組，其余25只作為造模組，每天予以皮下注射5 mg/（kg·d）丙酸睪酮，連續(xù)注射4周后，隨機(jī)取正常組和造模組各4只大鼠，比較兩組大鼠的前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數(shù)，光鏡下評(píng)價(jià)大鼠前列腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，判斷模型是否制備成功。將造模組剩下的21只大鼠隨機(jī)分模型組、中藥對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各7只。造模成功后開(kāi)始給藥，大鼠實(shí)驗(yàn)用劑量采用人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法來(lái)?yè)Q算得大鼠益腎通癃膠囊的灌胃劑量為0.365 g/（kg·d），癃閉舒膠囊的灌胃劑量為0.183 g/（kg·d）。每天給實(shí)驗(yàn)組大鼠灌服“益腎通癃膠囊”0.365 g/（kg·d）;中藥對(duì)照組灌服“癃閉舒膠囊”0.183 g/（kg·d）;正常組及模型組予以生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8周，灌胃結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5? 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1? 各組大鼠前列腺組織形態(tài)變化? 取大鼠前列腺組織固定于10%福爾馬林溶液中，之后予以乙醇脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠前列腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.2? 各組大鼠前列腺體積、濕重及前列腺指數(shù)? 將大鼠稱(chēng)重后迅速處死，剖取前列腺組織，用水取代法測(cè)量前列腺體積，稱(chēng)取大鼠前列腺濕重，計(jì)算前列腺指數(shù)。

前列腺指數(shù)=前列腺濕重/大鼠體質(zhì)量×100%

1.5.3? 大鼠血清E2、T、DHT及E2/T指標(biāo)檢測(cè)? 剖腹后采腹主動(dòng)脈血，以3 000 r/min 4 ℃離心15 min后，取上清液裝入普通試管，存放于-70 ℃冷凍箱中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

1.5.4? 大鼠前列腺組織HIF-1α蛋白表達(dá)量? 取大鼠前列腺組織，置于勻漿器球狀部位，用剪刀盡量剪碎組織塊后，加入800 μL含PMSF的裂解液冰上進(jìn)行勻漿，重復(fù)碾轉(zhuǎn)數(shù)次盡量碾碎組織，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后，取上清分裝于1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取100 μL不同處理的組織蛋白樣本，BCA法測(cè)蛋白濃度，隨后加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min后，取20 μg進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后，按照“三明治”模式，300 mA 2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，使用HIF-1α一抗，并4 ℃孵育過(guò)夜。隨后用1% TBST洗膜3次后，使用HRP二抗在室溫孵育1.5 h，再用1% TBST洗膜3次。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，使用Image-Pro Plus圖像分析管理軟件進(jìn)行灰度掃描，以特異性條帶平均光密度與面積的乘積為有效值，來(lái)反映蛋白表達(dá)水平。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 大鼠前列腺組織形態(tài)變化

正常組（圖1A）見(jiàn)大鼠前列腺腺體排列均勻，腺體間間質(zhì)明顯，腺上皮細(xì)胞呈單層柱狀;模型組（圖1B）見(jiàn)大鼠前列腺腺體顯著增生，腺腔變大，大小不一，多數(shù)腺上皮呈乳頭狀增生向腺腔內(nèi)突出，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維組織增生，說(shuō)明造模成功。中藥對(duì)照組（圖1C）見(jiàn)大鼠前列腺腺體和部分纖維組織仍增生明顯，較模型組有一定改善;實(shí)驗(yàn)組（圖1D）見(jiàn)大鼠前列腺腺體輕微增生，腺上皮多為柱狀單層，少數(shù)呈乳頭狀增生，腺腔基本恢復(fù)正常，較模型組有很大改善。

2.2? 各組大鼠前列腺體積、濕重及前列腺指數(shù)

與正常組相比，模型組大鼠前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數(shù)均顯著增加（P<0.01），說(shuō)明造模成功。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和中藥對(duì)照組BPH模型大鼠前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數(shù)均降低（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.3? 各組大鼠血清雌雄激素水平

與正常組相比，模型組大鼠血清DHT、E2、T明顯升高（P<0.01），E2/T明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，中藥對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠血清DHT、E2、T均降低（P<0.01），E2/T明顯升高（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.4? 各組大鼠前列腺組織中HIF-1α蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組大鼠HIF-1α水平顯著增高（P<0.01）;與模型組相比，中藥對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HIF-1α水平均降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)圖2。

3 討論

BPH是臨床常見(jiàn)的中老年男性良性疾病，該病病機(jī)復(fù)雜，病程較長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，西醫(yī)治療該病以藥物和手術(shù)治療為主，常用藥物有α1受體阻斷劑和5α-還原酶抑制劑，其作用是緩解尿路癥狀，解除梗阻，延緩進(jìn)程，抑制并縮小前列腺體積、降低遠(yuǎn)期并發(fā)癥等[9]。對(duì)于具備手術(shù)指征而無(wú)手術(shù)禁忌癥，且藥物治療效果不明顯的患者，則采取手術(shù)治療，但手術(shù)治療有一定風(fēng)險(xiǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病基本病機(jī)為腎虛血瘀，治療以補(bǔ)腎益氣，活血化瘀為主[6]。精癃的發(fā)生關(guān)鍵在于腎氣虧虛，氣虛則腎與膀胱氣化無(wú)力，統(tǒng)攝失權(quán)，夜尿頻多;氣虛至血行無(wú)力，氣虛瘀阻，引起局部組織器官增生。因此，以補(bǔ)腎益氣，活血化瘀為基本治法，并創(chuàng)制益腎通癃膠囊，其藥物組成有：黃芪、補(bǔ)骨脂、水蛭、枸杞子、山藥、熟地黃、山茱萸、金櫻子、茯苓、甘草等。方中補(bǔ)骨脂、黃芪共為君藥以補(bǔ)益腎氣;水蛭破血逐瘀;山藥、山茱萸、熟地黃、枸杞滋補(bǔ)腎陰，寓陽(yáng)中有陰，陰中有陽(yáng)之意;金櫻子酸澀收斂，固精縮尿;茯苓益氣健脾，甘草調(diào)和諸藥;全方共奏補(bǔ)腎益氣，化瘀縮尿之功效。

前列腺是雄激素依賴(lài)性器官，雄激素是調(diào)控前列腺生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)維持及功能完整的重要激素。但雄激素并不是引起B(yǎng)PH發(fā)生的唯一性激素，雌激素在BPH發(fā)生中也發(fā)揮重要作用，但雌激素在BPH中發(fā)揮作用需以雄激素存在為前提，在一定雌/雄激素比例范圍內(nèi)時(shí)，可協(xié)同雄激素促進(jìn)前列腺增生[10]。因此調(diào)節(jié)雌/雄激素比對(duì)于治療前列腺增生有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，益腎通癃膠囊可顯著降低大鼠血清中的DHT、E2、T水平，升高E2/T比值（P<0.01），說(shuō)明益腎通癃膠囊可能通過(guò)降低血清中DHT、E2、T水平，升高E2/T比值，從而達(dá)到抑制前列腺增生作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可能是激活“血管生成開(kāi)關(guān)”的關(guān)鍵信號(hào)因子，其能夠?qū)е赂鞣N血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)增加，包括VEGF和堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）[9]。周鵬等[11]發(fā)現(xiàn)前列腺內(nèi)注射A型肉毒毒素可以通過(guò)抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)，從而抑制前列腺組織的血管形成，使前列腺體積縮小;并探討其可能機(jī)制是隨著前列腺體積不斷增大，導(dǎo)致血供不足出現(xiàn)缺氧壞死，缺氧會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α過(guò)度表達(dá)，從而增加VEGF的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管的形成，導(dǎo)致前列腺增生的發(fā)生。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠前列腺組織中HIF-1α水平顯著增高（P<0.01），而益腎通癃膠囊能顯著降低大鼠前列腺組織中的HIF-1α水平（P<0.01），說(shuō)明益腎通癃膠囊可能是通過(guò)抑制HIF-1α的表達(dá)，達(dá)到治療前列腺增生的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] PARK H J， WON J E， SORSABURU S， et al. Urinary tract symptoms （LUTS） secondary to benign prostatic hyperplasia （BPH） and LUTS / BPH with erectile dysfunction in Asian men： A systematic review focusing on tadalafil[J]. World Journal of Mens Health， 2013，31（3）：193-207.

[2] 楊? 偉，趙? 紅.良性前列腺增生癥的中醫(yī)治療研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2019，7（5）：84-85.

[3] 李拔森，王? 良.良性前列腺增生介入治療的現(xiàn)狀和進(jìn)展[J].影像診斷與介入放射學(xué)，2017，26（3）：230-235.

[4] 徐廣馳，劉? 濤，董? 波，等.大豆異黃酮抑制大鼠前列腺增生及其作用機(jī)制[J].解剖學(xué)報(bào)，2018，49（2）：185-190.

[5] ATAWIA R T， MOSLI H H， TADROS M G， et al. Modulatory effect of silymarin on inflammatory mediators in experimentally induced benign prostatic hyperplasia： emphasis on PTEN， HIF-1α， and NF-κB[J]. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology，2014，38，7（12）：1131-1140.

[6] 陳其華，趙? 丹，王大進(jìn)，等.自擬方藥益腎通癃膠囊治療前列腺增生癥療效觀察[J].中國(guó)性科學(xué)，2016，25（2）：90-92.

[7] 楚元奎，楊? 文，冉林武，等.前列腺增生大鼠模型的建立[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，39（5）：657-659，663.

[8] 胡金輝，周? 青，黃艷菇，等.前癃通膠囊抑制良性前列腺增生基質(zhì)細(xì)胞TGF-？茁1表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（7）：12-14.

[9] 王? 斌，肖明艷.α1A阻滯劑與5α-還原酶抑制劑治療BPH療效觀察[J].中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2019，11（5）：129-131.

[10] 劉臻偉.雌雄激素與良性前列腺增生關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合研究，2012，4（2）：105-106.

[11] 周? 鵬，張心男，徐智慧.A型肉毒毒素對(duì)大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué)，2014，36（5）：401-404.

（本文編輯? 蘇? 維）