UPLC-FLD 法同時測定不同產(chǎn)地白芷中5 種香豆素

李 乾，劉 潔，李月婷，陽 嬌，趙淑軍，肖紅斌，3*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

白芷為傘形科植物植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ExHoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.Ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan 的干燥根，味辛、性溫，歸胃、大腸、肺經(jīng)，具有發(fā)散風(fēng)寒、通竅止痛、燥濕止帶、消腫排膿等功效，臨床常用于治療陽明頭痛、眉棱骨痛、鼻淵頭痛、牙痛、風(fēng)寒濕痹、瘡瘍腫毒等病癥［1］。白芷含有的化學(xué)成分主要有香豆素類、揮發(fā)油類、多糖類、甾醇類及生物堿等［2-4］。文獻(xiàn)報道其有效成分主要為歐前胡素、異歐前胡素等香豆素類［5-7］。2015 年版《中國藥典》一部以歐前胡素為指標(biāo)成分來評價白芷質(zhì)量，歐前胡素的總量不得低于0.080%［1］。近年來有文獻(xiàn)表明歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、水合氧化前胡素能夠進(jìn)入血液及腦脊液［8-9］且佛手柑內(nèi)酯［10-12］、氧化前胡素［13-14］均有明顯的抗炎抗腫瘤作用。因此，僅以歐前胡素作為評價指標(biāo)，不能全面地評價白芷的質(zhì)量。

HPLC 法是目前測定白芷中香豆素含有量的主要方法［15］，也有超臨界流體色譜法［16］、近紅外光譜法［17］、LC-MS 法［18］等。白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素，具有苯環(huán)（π*-π*）結(jié)構(gòu)特征，其有較強(qiáng)的熒光吸收。熒光分析方法具有選擇性好，靈敏度高等特點，比紫外-可見分光光度法低3 個數(shù)量級以上。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，相比于紫外檢測器，熒光檢測器有更好的選擇性［19］；相比于三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜，熒光檢測器花費更少［8］。此外，鑒于傳統(tǒng)HPLC 方法測定白芷中香豆素類成分含有量耗時長，同時存在干擾峰的問題。因此，本研究以期開發(fā)保留時間更短、特異性和選擇性更好的UPLC-FLD 測定方法，對白芷中5 種香豆素類成分同時測定，并對21 批不同產(chǎn)地白芷中5 種成分進(jìn)行含有量測定，以期更準(zhǔn)確的評價白芷藥材的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 1260 G1321B 熒光檢測器（美國Agilent 公司）；Milli-Q 超純水制備儀（德國Millipore 公司）；AT201 型電子天平（1/10 萬，瑞士Mettler Toledo 公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 對照品歐前胡素（O-001-170526）、異歐前胡素（Y-007-170426）、水合氧化前胡素（S-128-170426）、氧化前胡素（Y-151-180713）、佛手柑內(nèi)酯（F-008-170426）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma 公司）。

1.3 樣品 白芷藥材購買于河北安國藥材市場和安徽亳州藥材市場，信息見表1，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇教授鑒定為正品，憑證樣本留樣存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX ECLIPSE Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10%～38% B，2～7 min，38%～39% B，7～9 min，39%～40% B，9～10 min，40%～55% B，10～14 min，55%～70%B，14～15 min，100% B）；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分熒光色譜圖Fig.1 Fluorescence chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 取對照品水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制備成水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為20、20、200、200、100 μg/mL 的混合對照品溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液制備 精密稱取白芷粉末（過5 號篩）約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（120 W，40 kHz）提取1 h，放冷。再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量。搖勻，靜置后取上清液，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 最佳波長確定 將“2.2”項下對照品溶液，在“2.1”項條件下進(jìn)樣2 針，分別獲取各化合物的激發(fā)波長（Ex）及發(fā)射波長（Em）曲線。獲取Ex 曲線時，先固定Em（如500 nm），將Ex 處設(shè)置為“zero order”，采集范圍設(shè)定為230～450 nm，掃描間隔為5 nm。獲取Em 曲線時，先固定Ex（如250 nm），將Em 處設(shè)置為“zero order”，采集范圍設(shè)定為300～600 nm，間隔為5 nm。分別進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取制備好的混合對照品貯備液，采用逐級稀釋的方法，即得不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 定量下限 按10 倍信噪比計算，水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的定量下限分別為10、10、10、20、10 ng/mL。

2.5.3 精密度試驗 取對照品溶液5 μL，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣7 針，水合氧化前胡素保留時間RSD 為0.06%，峰面積RSD 為0.92%；佛手柑內(nèi)酯保留時間RSD 為0.08%，峰面積RSD 為0.80%；氧化前胡素保留時間RSD 為0.08%，峰面積RSD 為0.83%；歐前胡素保留時間RSD 為0.03%，峰面積RSD 為0.87%；異歐前胡素保留時間RSD 為0.03%，峰面積RSD 為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣5 μL，測定水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的峰面積，其中RSD 分別為0.77%、0.76%、0.35%、0.70%、0.33%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別進(jìn)樣。測得水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的平均含有量分別為0.36、0.35、3.76、2.84、1.08 mg/g，RSD 分別為2.56%、4.17%、1.81%、1.86%、1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的四川白芷粉末0.5 g，分別精密加入混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算各成分回收率。結(jié)果見表3。

2.6 樣品含有量測定 精密稱取不同產(chǎn)地21 批白芷粉末各1 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 熒光檢測波長確定 按“2.4”項下方法得水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的最大激發(fā)波長區(qū)間分別為259～262、259～262、255～258、253～254、259～260 nm，最大發(fā)射波長分別為494～498、495～500、486～490、484～487、484～487 nm。并以氧化前胡素為例展示其激發(fā)及發(fā)射波長曲線。為確保5 種成分同時均有較強(qiáng)吸收，最終確定了熒光檢測器的Ex 為259 nm，Em 為490 nm。

3.2 色譜條件優(yōu)化 在實驗過程中，流動相為純水-乙腈時，出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象。加入0.1%甲酸后能夠有效改善峰拖尾現(xiàn)象。最后對梯度洗脫比例進(jìn)行了摸索，在保證R≥1.5 的前提下，使分析時間在15 min 內(nèi)達(dá)到全部分離。

3.3 熒光檢測器與紫外檢測器比較 熒光分析方法的主要優(yōu)點是靈敏度高，選擇性好，檢測限達(dá)10-10g/mL，相較紫外-可見分光光度法低3 個數(shù)量級以上。本研究發(fā)現(xiàn)白芷樣品的紫外色譜圖在峰1（水合氧化前胡素）和峰3（氧化前胡素）處有其他物質(zhì)干擾，而其熒光色譜圖不存在干擾峰，且熒光色譜峰基線平穩(wěn)。因此，本研究所建立的熒光檢測方法圖譜雜質(zhì)干擾少，選擇性強(qiáng)，分離度好，靈敏度高。

3.4 結(jié)果分析 2015 年版《中國藥典》一部以歐前胡素為指標(biāo)成分來評價白芷質(zhì)量，歐前胡素的總量不得低于0.080%［1］。本研究采用UPLC-FLD 法

同時測定了不同地區(qū)共21 批樣品中5 種香豆素的含有量，結(jié)果表明安徽白芷中歐前胡素含有量最高，達(dá)到3.26 mg/g；而陜西商洛白芷中歐前胡素含有量最低，低至0.36 mg/g。此外，結(jié)果表明，浙江白芷中水合氧化前胡素和氧化前胡素含有量最高，分別為0.73、0.95 mg/g；而河北白芷中佛手柑內(nèi)酯和氧化前胡素含有量最高，分別為0.33、2.99 mg/g。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 不同產(chǎn)地樣品中各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in samples from different growing areas（mg/g）

3.5 指標(biāo)性成分選擇 文獻(xiàn)報道水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素可吸收進(jìn)入血液［8］，且水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、異歐前胡素可透過血腦屏障到達(dá)腦組織［9］；此外，課題組利用UPLC-FLD 檢測白芷入血成分時發(fā)現(xiàn)氧化前胡素也可吸收進(jìn)入血液，表明這5 種成分均直接影響著白芷的臨床療效。當(dāng)以5 種香豆素總含有量來評價白芷時，大部分產(chǎn)地中5 種香豆素總含有量較高，但陜西及湖南產(chǎn)地總香豆素含有量較低，5 種香豆素總含有量小于2.0 mg/g。本研究所得香豆素總含有量較高的產(chǎn)地與文獻(xiàn)報道的白芷5 大產(chǎn)區(qū)河北（祁白芷）、河南（禹白芷）、四川（川白芷）、杭州（杭白芷）、安徽（亳白芷）相一致［20-21］。因此，建議將水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、異歐前胡素、歐前胡素、氧化前胡素這5 種成分作為白芷質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

4 結(jié)論

本研究建立的UPLC-FLD 法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好，對不同產(chǎn)地白芷中5 種香豆素的含有量進(jìn)行測定。該方法首次應(yīng)用于白芷藥材中香豆素含有量的檢測，相較于紫外檢測器，熒光檢測器有其固有的特異性和選擇性。以期為白芷藥材的含有量測定提供一種新方法，也為中藥復(fù)雜體系及體內(nèi)香豆素類成分含有量測定提供參考。