胸水中EGFR基因突變檢測(cè)在酪氨酸激酶抑制劑治療肺腺癌中的應(yīng)用

趙俊軍 李平

【摘要】 目的 探究胸水中表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變檢測(cè)在酪氨酸激酶抑制劑治療肺腺癌中的應(yīng)用效果。方法 176例突變肺腺癌患者， 采用表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）治療12個(gè)月后均復(fù)發(fā)胸水， 對(duì)胸水樣本進(jìn)行收集， 制作胸水細(xì)胞塊， 提取各樣本脫氧核糖核酸（DNA）， 使用人類(lèi)ADx-EGFR 基因突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胸水中EGFR T790M耐藥突變情況， 并對(duì)其影響因素進(jìn)行分析。結(jié)果 176例EGFR-TKI治療耐藥患者的胸水樣本中， T790M基因突變128例， 占比為72.7%， 無(wú)T790M基因突變48例， 占比為27.3%。男性發(fā)生T790M基因突變60例（74.07%）， 女性發(fā)生T790M基因突變68例（72.29%）;<65歲患者發(fā)生T790M基因突變36例（69.23%）， ≥65歲患者發(fā)生T790M基因突變92例（74.19%）;吸煙患者發(fā)生T790M基因突變47例（73.44%）， 非吸煙患者發(fā)生T790M基因突變81例（72.32%）;腺癌患者發(fā)生T790M基因突變121例（73.33%）， 非腺癌患者發(fā)生T790M基因突變7例（63.64%）;不同性別、年齡、吸煙情況、腺癌患者發(fā)生T790M基因突變的占比與非T790M突變患者比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 檢測(cè)胸水樣本中EGFR基因狀態(tài)對(duì)于預(yù)測(cè)EGFR-TKI耐藥性具有很好的應(yīng)用價(jià)值， 可為肺腺癌患者的耐藥臨床監(jiān)測(cè)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 肺腺癌;酪氨酸激酶抑制劑;表皮生長(zhǎng)因子受體;T790M;臨床監(jiān)測(cè)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.25.094

【Abstract】 Objective ? To investigate the effect of epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation detection on lung adenocarcinoma treated with tyrosine kinase inhibitor. Methods ? There were 176 patients with mutated lung adenocarcinoma treated with epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor （EGFR-TKI） in our hospital. After 12 months of treatment， all the patients had recurrent pleural effusion. The samples of pleural effusion were collected， and the cell blocks were made. The deoxyribonucleic acid （DNA） of each sample was extracted. The EGFR T790M resistance mutation in pleural effusion was detected by human ADx-EGFR gene mutation detection kit， and the influencing factors were analyzed. Results ? In 176 patients with drug resistance treated by EGFR-TKI， 128 cases had T790M gene mutation， accounting for 72.7%， and 48 cases had no T790M gene mutation， accounting for 27.3%. 60 cases （74.07%） of males with T790M gene mutation， 68 cases （72.29%） of females with T790M gene mutation; there were 36 cases （69.23%） of T790M gene mutation in patients <65 years old，?92 cases （74.19%） in patients ≥65 years old; 47 cases （73.44%） in smoking patients， 81 cases （72.32%） in non-smoking patients; 121 cases （73.33%） in adenocarcinoma patients and 7 cases （63.64%） in non-adenocarcinoma patients. There was no statistically significant difference in the proportion of T790M gene mutation between patients with different gender， age， smoking and adenocarcinoma compared with those without T790M mutation （P>0.05）. Conclusion ? The detection of EGFR gene status in pleural fluid samples has a good application value in predicting the resistance of EGFR-TKI， and can provide a reference for clinical monitoring of drug resistance in patients with lung adenocarcinoma.

【Key words】 Lung adenocarcinoma; Tyrosine kinase inhibitor; Epidermal growth factor receptor; T790M; Clinical monitoring

肺癌是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康的疾病之一， 目前已成為世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。腫瘤病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明， 但從腫瘤細(xì)胞學(xué)來(lái)看， 肺癌發(fā)生的本質(zhì)在于細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)失控。積極尋找特效和低毒的抗腫瘤藥物是人類(lèi)面臨的緊迫任務(wù)之一。靶向治療不但具有較好的療效和疾病控制率， 且毒副反應(yīng)較輕， 是臨床上肺腺癌癌患者治療的最佳選擇[1]。以厄洛替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑類(lèi)藥物在一線(xiàn)治療中被廣泛使用[2]。然而， 目前靶向治療面臨的最大問(wèn)題是治療過(guò)程中耐藥性的產(chǎn)生[3]。腺癌中主要的驅(qū)動(dòng)基因包括EGFR、鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因（KRAS）、鼠類(lèi)肉瘤病毒病毒癌基因同源物BI（BRAF）等的突變， 對(duì)臨床用藥情況進(jìn)行敏感性監(jiān)控， 對(duì)于控制疾病發(fā)展和延長(zhǎng)患者生存期有著十分重大和積極的意義[4]。近年來(lái)， 血液樣本液體活檢技術(shù)在臨床上由于其具有的取樣便捷和實(shí)時(shí)監(jiān)控等特點(diǎn)， 得到越來(lái)越多的應(yīng)用， 但是其在胸水中的應(yīng)用并不常見(jiàn)[5， 6]。有研究表明胸水腫瘤細(xì)胞的含量要遠(yuǎn)大于血液中游離的腫瘤細(xì)胞[7]。本研究對(duì)經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑治療的肺腺癌患者復(fù)發(fā)胸水中EGFR基因突變進(jìn)行檢測(cè)， 以期為臨床上胸水中基因突變檢測(cè)應(yīng)用于肺腺癌患者的耐藥監(jiān)測(cè)提供參考。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2016年1月～2018年6月收治的176例突變肺腺癌患者， 其中男81例， 女95例;年齡35～80歲， 平均年齡（57.52±5.75）歲?；颊叽_診為非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC）， 患者無(wú)化療治療史， 或有過(guò)化療經(jīng)歷但已從不良反應(yīng)中恢復(fù)。患者及其家屬均對(duì)研究過(guò)程有清楚明確認(rèn)知， 并在研究同意書(shū)上簽字。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1. 2 研究方法 患者均接受EGFR-TKI治療， 治療12個(gè)月后均復(fù)發(fā)胸水， 對(duì)胸水樣本進(jìn)行收集。采集胸水樣本30 ml， 3000 r/min離心10 min， 收集細(xì)胞沉淀， 如沉淀量不夠可以進(jìn)行重復(fù)離心收集， 將樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)， 提取胸水細(xì)胞DNA。利用紫外線(xiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)各樣本DNA的濃度和純度（A260/280在1.8～2.0）。將樣本的DNA按照人類(lèi)ADx-EGFR 基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行EGFR T790M耐藥突變的檢測(cè)。檢測(cè)胸水中EGFR T790M耐藥突變。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 EGFR-TKI治療后出現(xiàn)T790M突變情況分析176例EGFR-TKI治療耐藥患者的胸水樣本中， T790M基因突變128例， 占比為72.7%， 無(wú)T790M基因突變48例， 占比為27.3%。

2. 2 T790M突變的影響因素分析 男性發(fā)生T790M基因突變60例（74.07%）， 女性發(fā)生T790M基因突變68例（72.29%）;<65歲患者發(fā)生T790M基因突變36例（69.23%）， ≥65歲患者發(fā)生T790M基因突變92例（74.19%）;吸煙患者發(fā)生T790M基因突變47例（73.44%）， 非吸煙患者發(fā)生T790M基因突變81例（72.32%）， ;腺癌患者發(fā)生T790M基因突變121例（73.33%）， 非腺癌患者發(fā)生T790M基因突變7例（63.64%）;不同性別、年齡、吸煙情況、腺癌患者發(fā)生T790M基因突變的占比與非T790M突變患者比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

肺癌作為發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤， 嚴(yán)重地威脅著人類(lèi)的健康[8-10]。目前， 隨著生態(tài)環(huán)境的改變， 以及吸煙人數(shù)的增多， 肺癌每年發(fā)病率都在上升， 且具有較高致死率。肺腺癌的發(fā)病率占比能達(dá)到80%～85%， 其5年死亡率>80%[11-14]。肺癌組織學(xué)分類(lèi)主要由小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類(lèi)， 非小細(xì)胞肺癌可占到85%， 其主要由腺癌、鱗癌、大細(xì)胞癌及其他類(lèi)型肺癌組成， 腺癌患者人數(shù)最多。靶向治療已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)療發(fā)展的大方向， 給患者帶來(lái)了更好的康復(fù)機(jī)會(huì)， 但靶向治療仍然不可避免耐藥性， 所以當(dāng)前對(duì)藥物耐藥性的研究和探索正逐漸成為臨床研究的重要內(nèi)容和主流方向。晚期肺腺癌的致死率非常高， 而隨著醫(yī)學(xué)對(duì)基因組探究的深入治療方法已經(jīng)有了質(zhì)的改變， 主流的治療方式已經(jīng)由化療變成以基因檢測(cè)為向?qū)ч_(kāi)展的精準(zhǔn)治療[15-17]。

EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂上， 包含28個(gè)外顯子， 大小約170 kD， EGFR-TKI可顯著提高EGFR基因的突變陽(yáng)性， EGFR-TKI治療中EGFR基因突變型NSCLC易出現(xiàn)T790M突變[18， 19]。所以對(duì)T790M突變的監(jiān)測(cè)對(duì)治療具有非常重要而長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響。為了尋找易獲得的標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)， 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者將注意力集中在了胸水和外周血上。惡性胸腔積液是晚期非小細(xì)胞肺癌患者的常見(jiàn)癥狀， 采集胸水標(biāo)本具有操作風(fēng)險(xiǎn)小、檢出率高、與組織標(biāo)本高度一致等優(yōu)點(diǎn)[20-22]。使用胸水進(jìn)行T790突變檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性， 在檢測(cè)費(fèi)用等方面可能比血液檢測(cè)更具有優(yōu)勢(shì)， 可以在耐藥早期監(jiān)控非小細(xì)胞肺癌患者酪氨酸激酶抑制劑耐藥性， 及時(shí)調(diào)整治療方案。本次研究中176例EGFR-TKI治療耐藥患者的胸水樣本中， T790M基因突變128例， 占比為72.7%， 無(wú)T790M基因突變48例， 占比為27.3%。男性發(fā)生T790M基因突變60例（74.07%）， 女性發(fā)生T790M基因突變68例（72.29%）;<65歲患者發(fā)生T790M基因突變36例（69.23%）， ≥65歲患者發(fā)生T790M基因突變92例（74.19%）;吸煙患者發(fā)生T790M基因突變47例（73.44%）， 非吸煙患者發(fā)生T790M基因突變81例（72.32%）， ;腺癌患者發(fā)生T790M基因突變121例（73.33%）， 非腺癌患者發(fā)生T790M基因突變7例（63.64%）;不同性別、年齡、吸煙情況、腺癌患者發(fā)生T790M基因突變的占比與非T790M突變患者比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說(shuō)明T790M基因突變與性別、年齡、是否吸煙等均無(wú)關(guān)系。魏媛等[17]在對(duì)T790M與晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKI繼發(fā)耐藥和預(yù)后的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)T790M陽(yáng)性突變與晚期非小細(xì)胞肺癌患者的年齡、性別、臨床分期等均無(wú)相關(guān)性， 與本研究結(jié)果相一致。

總之， 檢測(cè)胸水樣本中EGFR基因狀態(tài)對(duì)于預(yù)測(cè)EGFR-TKI耐藥性具有很好的應(yīng)用價(jià)值， 為臨床檢測(cè)提供方便有效的診斷方法， 便于臨床開(kāi)展實(shí)施， 具有很好的應(yīng)用前景。

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[收稿日期：2020-03-23]