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    羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白酶法提取工藝及特性研究

    2020-10-13 07:36:34錢(qián)玉梅李紅俠陳紅玲
    關(guān)鍵詞:魚(yú)皮保水羅非魚(yú)

    王 晴,錢(qián)玉梅,李紅俠,陳紅玲

    (1.宿州學(xué)院,安徽 宿州 234000; 2. 宿州市天然產(chǎn)物與功能性食品工程技術(shù)研究中心,安徽 宿州 234000)

    0 引言

    近些年來(lái),我國(guó)漁業(yè)發(fā)展迅速,已躋身于全球第一漁業(yè)大國(guó),在加工生產(chǎn)過(guò)程中不可避免地產(chǎn)生魚(yú)皮、魚(yú)鱗、魚(yú)鰾等廢棄物,這些廢棄物的充分利用可以提高漁業(yè)加工的附加價(jià)值,增加經(jīng)濟(jì)效益,反過(guò)來(lái)促進(jìn)漁業(yè)的發(fā)展[1-2]。經(jīng)研究表明魚(yú)皮中含有豐富的膠原蛋白,膠原蛋白是一種白色不透明無(wú)支鏈的纖維狀蛋白質(zhì),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)中,例如功能食品、食品添加劑、食品包裝材料等[3],因此以水產(chǎn)加工廢棄物魚(yú)皮為原料制備膠原蛋白具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。以羅非魚(yú)魚(yú)皮為材料,采用胃蛋白酶法提取,利用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化胃蛋白酶酶法提取的最優(yōu)條件,并對(duì)胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的溶解性能和保水性能進(jìn)行研究,為水產(chǎn)膠原蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù),以期提高漁業(yè)的附加價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羅非魚(yú)魚(yú)皮(廣東湛江水產(chǎn)有限公司)、胃蛋白酶、無(wú)水乙醇、氯化鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、硫酸、氯胺T、乙酸等均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SP-723分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、GL-23M高速離心機(jī)(湖南湘儀集團(tuán))等。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 羅非魚(yú)魚(yú)皮的預(yù)處理

    將去鱗魚(yú)皮剪碎(約3 × 3 mm),用 0.1 M NaOH溶液浸泡24 h,以去除脂肪和部分雜蛋白,然后洗至中性,再用正己烷浸泡脫脂24 h,真空冷凍干燥后,粉碎(10目)[4]。

    1.3.2 胃蛋白酶法提取魚(yú)皮膠原蛋白單因素試驗(yàn)

    將粉碎后的魚(yú)皮置于含有胃蛋白酶(200 U/mg)的預(yù)冷0.5 M乙酸溶液中,調(diào)節(jié)pH,并于水浴鍋中在一定溫度下連續(xù)攪拌提取一定時(shí)間,取上清,緩慢加入NaCl至最終濃度0.9 M,鹽析過(guò)夜,然后2 500 g離心30 min,棄上清,將沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl緩沖液中,再次于20 000 g離心1 h,取上清透析脫鹽48 h得到膠原蛋白提取液[5]。

    1.3.3膠原蛋白提取率測(cè)定

    羥脯氨酸含量按GB/T 9695.23-2008測(cè)定,膠原蛋白提取率含量按下式計(jì)算[4]:

    其中,X——膠原蛋白提取率,%;c——羥脯氨酸含量;11.1——換算系數(shù).

    1.3.4正交試驗(yàn)

    以單因素結(jié)果為依據(jù)建立因素水平表(表1),以膠原蛋白提取率為評(píng)判指標(biāo),按照L9(34)正交表來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

    1.3.5 溶解性測(cè)定

    酶解提取的膠原蛋白冷凍干燥,取一定質(zhì)量溶于0.5 mol/L醋酸中,使得濃度為5 mg/mL。取5 mL分別調(diào)至pH為2、3、4、5、6、7、8、9,保持pH值不變,蒸餾水定容至10 mL, 4000 r/min離心15 min,,雙縮脲法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量,并同時(shí)將樣品溶于0.5 mol/L醋酸溶液,采用雙縮脲法測(cè)定樣品總蛋白含量,用公式(1)計(jì)算溶解性[6]。

    (1)

    1.3.6 保水性測(cè)定

    量取50 mL蒸餾水,加入凍干后的膠原蛋白 0.05 g,攪拌,置于1000 r/min條件下離心5 min,棄分離水,稱(chēng)量殘留物質(zhì)量,并置于25℃干燥箱中,每隔20 min測(cè)一次質(zhì)量,按公式(2)計(jì)算水分殘存率[6],以測(cè)定其保水性強(qiáng)弱。

    (2)

    式中:Y表示水分殘存率%;m0表示離心剩余物質(zhì)量/g;m表示每隔一段時(shí)間剩余物質(zhì)量/g。

    2結(jié)果與討論

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    設(shè)置酶解溫度40℃,料液比1:70,pH 3,酶解時(shí)間分別為5、10、15、20、25 h時(shí),膠原蛋白的提取率如圖1所示,當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí),膠原蛋白尚未被完全酶解,故隨著時(shí)間的延長(zhǎng),膠原蛋白與酶能夠充分結(jié)合,反應(yīng)速率加快,膠原蛋白的酶解量不斷增大,膠原蛋白提取率也不斷增加,但當(dāng)膠原蛋白提取率上升到某一極限值后,再延長(zhǎng)提取時(shí)間則對(duì)膠原蛋白提取率影響較小[7]。因此,從使膠原蛋白充分被酶解且節(jié)省時(shí)間的角度考慮,最適宜提取時(shí)間選取15 h。

    圖1 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響 圖2 提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    2.1.2提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    設(shè)置酶解時(shí)間15 h,料液比1:70,pH 3,酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃時(shí),膠原蛋白的提取率如圖2所示,在35~50 ℃時(shí),膠原蛋白提取率隨溫度的上升持續(xù)增加,但當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃,膠原蛋白提取率出現(xiàn)下降,因?yàn)闇囟冗^(guò)高,不利于胃蛋白酶活性的發(fā)揮,致使其酶解作用減弱[8]。因此,最適提取溫度選用50 ℃。

    2.1.3料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    設(shè)置酶解時(shí)間15 h,酶解溫度50 ℃,pH 3,料液比分別為1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90 g/mL時(shí),膠原蛋白的提取率如圖3所示,料液比位于1:40至1:70之間,膠原蛋白提取率不斷上升,料液比為1:80時(shí),膠原蛋白提取率開(kāi)始下降,可能由于當(dāng)液料比低于1:70時(shí),膠原蛋白酶解時(shí)溶劑不充足,當(dāng)料液比大于1:70時(shí),溶劑開(kāi)始過(guò)量,此時(shí)酶解液稀釋?zhuān)z原蛋白提取率反而降低[9],因此料液比選為1:70。

    2.1.4 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    設(shè)置酶解時(shí)間15 h,酶解溫度50 ℃,料液比1:70,pH分別為1、2、3、4、5、6時(shí),膠原蛋白的提取率如圖4所示,pH小于3時(shí),膠原蛋白提取率隨酸性減少而增加,當(dāng)pH值增加到3時(shí),膠原蛋白提取率最大,隨后便隨著酸性減少而減低。且酸性越低降低越迅速,表明pH值過(guò)低或過(guò)高均會(huì)對(duì)胃蛋白酶的活性有所抑制,可能通過(guò)影響胃蛋白酶分子的構(gòu)象、解離狀態(tài)及膠原蛋白的解離狀態(tài),進(jìn)而影響胃蛋白酶活力和酶解反應(yīng)速率,另一方面,較高的pH可能引入更多的雜質(zhì)離子,污染反應(yīng)環(huán)境[10]。所以,胃蛋白酶提取膠原蛋白的最適pH為3。

    圖3 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響 圖4 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

    2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    如表2所示,四個(gè)因素主次順序?yàn)锳>B>C>D,最優(yōu)條件組合為A2B2C1D1,即最佳的提取條件為酶解時(shí)間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2。按照最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得膠原蛋白提取率為90.3%,高于表2中各組合的膠原蛋白提取率,說(shuō)明了該方法可靠定,因此可用于優(yōu)化胃蛋白酶酶解提取膠原蛋白的最佳提取工藝條件。

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 酶法提取膠原蛋白特性分析

    2.3.1羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白溶解性能

    從圖5可以看出,隨著pH值的上升,羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的溶解度呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì),在酸性條件下溶解性能大于堿性,且酸性越高,溶解性能越好,pH在3以下,膠原蛋白溶解度達(dá)70%以上,當(dāng)pH超過(guò)3,溶解性能開(kāi)始迅速下降,中性條件下,溶解性能僅為25%左右。膠原蛋白溶解性隨 pH 的變化跟其等電點(diǎn)位置有關(guān),當(dāng)處于等電點(diǎn),兩性離子達(dá)到電荷平衡,溶解度達(dá)到最低,因此結(jié)果表明羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白等電點(diǎn)位于7 附近。

    圖5 羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白溶解性能 圖6 羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白保水性能

    2.3.2羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白保水性能

    由圖6可以看出,胃蛋白酶法提取的羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白水分殘存率隨時(shí)間增加現(xiàn)迅速后緩慢降低,但在360 min后仍保持在90%以上,可見(jiàn)其保水性能較好,可能由于胃蛋白酶酶切位點(diǎn)使得膠原蛋白暴露了較多的親水基團(tuán)。

    3 結(jié)論

    研究了酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比、pH對(duì)胃蛋白酶提取羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響,得到最佳酶解條件:酶解時(shí)間15 h、酶解溫度50 ℃、料液比1:60、pH為2時(shí),膠原蛋白提取率高達(dá)90.3%,該法提取的膠原蛋白溶解性能及保水性能較好,本研究為漁業(yè)資源的有效利用及膠原蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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