軟骨再生的研究進(jìn)展

杜艷平，孫永琨

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

由于軟骨沒有神經(jīng)組織和血管，一旦軟骨組織受到損傷，缺損面積較小時(shí)依靠機(jī)體自身修復(fù)可以填充空隙，但不可能完全恢復(fù)軟骨的正常結(jié)構(gòu)。而當(dāng)缺損大于3 mm時(shí)，即無法自行修復(fù)。因此，再生受損的軟骨備受關(guān)注，具有很大的技術(shù)發(fā)展?jié)摿?。?duì)于軟骨再生的研究主要集中在三個(gè)方面[1-4]：(1)誘導(dǎo)軟骨的自然愈合過程，如微骨折術(shù)；(2)移植能生成軟骨的細(xì)胞或組織，比如骨膜、軟骨膜 、骨軟骨或軟骨細(xì)胞等。(3)軟骨組織工程技術(shù)。

1 微骨折術(shù)

微骨折術(shù)是一種新型的微創(chuàng)手術(shù)，借助關(guān)節(jié)鏡直視作用，對(duì)軟骨缺損位置進(jìn)行定位，采用刨刀清除關(guān)節(jié)中已經(jīng)鈣化的軟骨。觀察無問題后，采用微骨折尖椎，在骨板上進(jìn)行鉆孔，骨髓和血液從孔中滲出，形成血液凝塊，里面含有的干細(xì)胞可以分化成纖維組織、纖維軟骨或者類透明軟骨構(gòu)成的替代性組織，修復(fù)原有受損的軟骨[5]。理查德·斯蒂德曼博士(Richard Steadman)在20世紀(jì)80年代和90年代初完善了這一手術(shù)，并且通過在馬上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究，逐漸改進(jìn)了治療方法。后來專業(yè)運(yùn)動(dòng)員開始注意到這種技術(shù)，專業(yè)運(yùn)動(dòng)員約翰·斯托克頓和安芬尼·哈達(dá)威均在手術(shù)取得成功后兩個(gè)月重返賽場(chǎng)，但兩人手術(shù)效果卻完全不同。斯托克頓打球到退役，而安芬尼很快又受傷了，并接受了第二次手術(shù)。目前的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，45歲或45歲以下的患者有75%至80%的成功率。

微骨折術(shù)操作簡單、損傷較少，治療小面積軟骨缺損的效果優(yōu)于大面積軟骨缺損，軟骨缺損的面積為2-4 cm2使用微骨折治療的效果不好[6]。微骨折軟骨修復(fù)為纖維軟骨修復(fù)，手術(shù)后生成的血液凝塊非常脆弱，修復(fù)后18個(gè)月內(nèi)即可見軟骨退變[7]。盡管軟骨存在退變現(xiàn)象，但是微骨折術(shù)后2年的時(shí)候臨床評(píng)分在仍然保持在較高水平[8]。

關(guān)節(jié)鏡下微骨折術(shù)在改善膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，保證患者的整體治療效果中起著關(guān)鍵作用[9]。這項(xiàng)技術(shù)隨著科技進(jìn)步也在不斷改良，如Stanish等[10]將殼聚糖與自體全血混合填充到微骨折治療的軟骨損傷中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法有利于增加血塊的穩(wěn)定性，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。另外Sharma等[11]成功應(yīng)用可注射性水凝膠結(jié)合微骨折修復(fù)不規(guī)則軟骨損傷。

研究報(bào)告稱骨髓刺激術(shù)在年輕患者中，特別是小范圍損傷的治療效果顯著，而對(duì)于年齡偏大者效果欠佳。以微骨折術(shù)的形式修復(fù)治療軟骨缺損的類型不是透明軟骨修復(fù)，而是纖維軟骨修復(fù)，極早就會(huì)發(fā)生退化，所以目前諸多研究致力于發(fā)展改良微骨折術(shù)。

2 移植能生成軟骨的細(xì)胞或組織

2.1 自體骨膜移植

骨膜位于骨表面， 外層為纖維層，內(nèi)層是生發(fā)層。 其中生發(fā)層含有很多的細(xì)胞成分，它始終保持分化增殖的能力。1982年，Rubak實(shí)驗(yàn)證明骨膜具有向軟骨轉(zhuǎn)化的能力，后來得到了更多的學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另外滑膜液為軟骨增生提供營養(yǎng)，將游離的骨膜放入滑膜液中，骨膜完全形成軟骨。

自體游離骨膜移植所取的骨膜以脛骨前方最佳。切取自體骨膜時(shí)采用銳性游離， 動(dòng)作輕柔，防止損傷骨膜內(nèi)層的生發(fā)層細(xì)胞。移植的骨膜應(yīng)與軟骨缺損區(qū)的骨面緊密固定縫合。固定骨膜時(shí)牽拉程度要適中，若過大會(huì)使單位面積上的細(xì)胞數(shù)量減少，會(huì)引起骨膜的撕脫和移位。反之，牽拉程度過小會(huì)使骨膜重疊，造成修復(fù)組織的不完整[12]。

楊貴勇等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)骨膜比滑膜和軟骨組織對(duì)相關(guān)基因表達(dá)作用更明顯，是因?yàn)楣悄け旧砗形捶只拈g充質(zhì)前體細(xì)胞較多，有分化生長的潛能。李稔生[14]認(rèn)為自體骨膜移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的近期臨床效果良好，但遠(yuǎn)期效果不佳。Madsen 等[15]報(bào)道了18例膝關(guān)節(jié)剝脫性骨軟骨炎患者自體骨膜移植后疼痛緩解者僅2例，其中 8 例(44%)術(shù)后8年中分別由于活動(dòng)受限、滑膜炎或骨贅形成而再次手術(shù)，認(rèn)為該方法緩解疼痛的比例小，再手術(shù)發(fā)生率高。

自體骨膜移植取材有限，骨膜形成軟骨面的能力受多種因素影響，比如年齡、供體的位置、移植的方向等，所以預(yù)期治療效果很難確定。

2.2 自體骨軟骨移植

1997年，Hangody首先報(bào)道了152例病例，是利用膝關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)的柱狀軟骨塊植入全層軟骨缺損區(qū)治療膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，最后獲得透明軟骨，且愈合速度也相對(duì)較快，取得了滿意的臨床效果。

Marcacci 等[16]對(duì)30例軟骨損傷面積小于 2.5 cm2的患者進(jìn)行自體骨軟骨移植。7年的隨訪結(jié)果表明，對(duì)于較小的軟骨損傷，中長期效果良好。Lane 等[17]發(fā)現(xiàn)面積小于2 cm2的軟骨損傷的修復(fù)效果最好，對(duì)面積為2～4 cm2的軟骨損傷也有較好的臨床效果。由于但受供區(qū)材料來源的限制，這種方法通常只用于損傷面積較小的患者。另外同種異體軟骨移植來源雖然廣泛，但由于移植排斥反應(yīng)及疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，一定程度上受到限制[18]。

2.3 自體軟骨細(xì)胞移植

自體軟骨細(xì)胞移植是將自體軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后移植到全層軟骨缺損區(qū)域的技術(shù)[19]。自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)首次實(shí)施成功是由1987年瑞典醫(yī)學(xué)家Peterson等[20]以兔子為模型上完成。1994年瑞典的Brittberg等[21]首次將這一方法運(yùn)用于臨床治療中。2003年P(guān)avesi等[22]用三維支架負(fù)載自體軟骨細(xì)胞，修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨缺損獲得較好效果。關(guān)節(jié)鏡檢96.7%修復(fù)基本滿意，主要缺損區(qū)修復(fù)為透明樣軟骨組織。自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)的出現(xiàn)，幫助很多軟骨損傷的患者看到了希望。隨著研究的發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)也在不斷創(chuàng)新。

第一代自體軟骨細(xì)胞移植技是在關(guān)節(jié)鏡下取關(guān)節(jié)軟骨，分離出軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，將細(xì)胞懸液注射至缺損處，最后覆蓋自體骨膜縫合，這種方法可以修復(fù)軟骨損傷的深度超過 6-8 mm[23]，但是也有許多缺點(diǎn)，如細(xì)胞懸濁液的外漏，骨膜的增生等，需要關(guān)節(jié)鏡進(jìn)行手術(shù)切除[24]。

第二代自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)是用一些生物膜如膠原膜等與周圍組織縫合，而不是用骨膜。研究表明，兩代的臨床療效相似，第二代的并發(fā)癥少于第一代[25]。雖然費(fèi)用比用自體骨膜高，但無需進(jìn)行二次手術(shù)，因此更為經(jīng)濟(jì)[26]。

第三代基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植是將體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞擴(kuò)增，植入Ⅰ/Ⅲ雙層膠原膜的粗糙表面，然后再植，最后使用更具生物相容性的纖維蛋白膠進(jìn)行粘接，消除了縫合的需要，使手術(shù)更容易，而且降低了細(xì)胞滲漏的風(fēng)險(xiǎn)[27]。

3 軟骨組織工程技術(shù)

20世紀(jì)90年代，多學(xué)科的發(fā)展使軟骨組織工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。構(gòu)建組織工程軟骨需要滿足三個(gè)條件：(1)足夠的正常功能的種子細(xì)胞；(2)合適的細(xì)胞支架；(3)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子[28-29]。

3.1 種子細(xì)胞

種子細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求：可以通過無創(chuàng)或微創(chuàng)方法獲得；分裂和增殖能力強(qiáng)；無免疫排斥；可連續(xù)傳代；傳代后形態(tài)、功能和遺傳物質(zhì)不發(fā)生變化。

首先自體軟骨細(xì)胞取自患者本身，沒有免疫排斥，細(xì)胞的相容性好，沒有倫理學(xué)障礙。然而，自體軟骨細(xì)胞是有限的，并且取材部位會(huì)有不同程度的損傷。此外，在體外傳代培養(yǎng)后很容易轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。

同種異體種子細(xì)胞應(yīng)用較多的是具有多向分化能力的干細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，可以轉(zhuǎn)化為軟骨。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞均為重要的種子細(xì)胞[30-31]。有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入軟骨缺損中，移植時(shí)未使用任何載體，發(fā)現(xiàn)新生組織為透明軟骨。由于其免疫原性低，細(xì)胞生命周期長，細(xì)胞分裂能力強(qiáng)，因此受到越來越多的關(guān)注。另有學(xué)者在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損時(shí)使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合I型膠原，結(jié)果植入的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，表面細(xì)胞形成透明軟骨組織。

此外，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡(EV)可促進(jìn)軟骨再生，并且降低了異常分化或腫瘤轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為是干細(xì)胞移植的替代品[32]。也有很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用多種細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，成本較低、效率較高，包括有成骨細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)體系、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系、以及軟骨細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)體系等[33-36]，共培養(yǎng)體系中細(xì)胞種植比例不同會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生各種不同的影響。

異種細(xì)胞是從動(dòng)物組織中獲得的細(xì)胞，來源廣泛，能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，然而，具有一定的免疫風(fēng)險(xiǎn)性[37]。目前，轉(zhuǎn)基因模型已經(jīng)建立，如果能夠免疫反應(yīng)及人畜共患疾病，異種細(xì)胞可以成為種子細(xì)胞。

3.2 支架

軟骨組織工程技術(shù)的支架相當(dāng)于細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)無毒，不引起炎癥，孔隙率高，能為細(xì)胞生長提供良好的微環(huán)境，植入后仍能保持形狀[38]。

最早用于軟骨組織工程的支架材料是PGA、PLA、PLGA 等[39]。單獨(dú)使用 PRP 凝膠作為支架，皮下植入后容易擠壓變形，特定形態(tài)的軟骨組織不能形成[40-41]。聚氨酯( PU) 材料可以通過CAD/CAM技術(shù)制成具有特定形態(tài)的多孔支架[42]。Algul 等[43]利用殼聚糖、海藻酸鹽、β—磷酸鈣制備了三層支架，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明促進(jìn)了軟骨缺損再生。另有利用 PRP 和軟骨細(xì)胞混合物置于PU支架中激活形成凝膠結(jié)構(gòu)，在裸鼠皮下可以構(gòu)建具有特定形態(tài)的軟骨[44]。改性后的天然高分子凝膠材料能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，甚至可以作為生長因子等的緩釋載體[45]。3D打印技術(shù)可以用于制備高精度的支架[46-48]，采用低溫沉積3D打印技術(shù)制備PLGA/DACECM 組織工程軟骨支架[49-50]，結(jié)果表明支架沒有細(xì)胞毒性，且具有優(yōu)異的性能[51]。Lin 等[52]研究也證實(shí)這種支架能更好地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)新生軟骨的形成。

通過整合制備工藝，構(gòu)建既能募集內(nèi)源性干細(xì)胞，又有利于新生組織成熟，仿生軟骨天然微環(huán)境及微結(jié)構(gòu)的組織工程軟骨支架將是研究的新方向[53]。

3.3 生長因子

生長因子的作用廣泛，在軟骨組織工程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，能夠誘導(dǎo)軟骨分化[54]。多種生長因子協(xié)同作用能增強(qiáng)軟骨再生的能力[55]。合適的刺激因子可以誘導(dǎo)軟骨定向分化，例如轉(zhuǎn)化生長因 子(TGF-β)[56]、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)[57]、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)[58]、血小板衍生生長因子(PDGF)[59]及肝細(xì)胞生長因子(HGF)[60]。有些生長因子能抑制組織工程軟骨吸收，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1[61-62]。軟骨細(xì)胞處于存在多種生長因子的微環(huán)境中，這些生長因子相互協(xié)同作用可促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成，比如bFGF和IGF-I、bFGF和TGF-β[63]。研究表明，聯(lián)合應(yīng)用多種生長因子的效果明顯好于單一一種[64]。Moussa 等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用富血小板血漿(PRP)細(xì)胞治療促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖，有助于軟骨修復(fù)。富血小板血漿(PRP)含有豐富的 PDGF、IGF-1和TGF-β等生長因子，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)損傷的治療[65-66]。

4 展望

患者年齡不同，關(guān)節(jié)軟骨缺損程度各異，那么如何選擇相應(yīng)的治療方法。針對(duì)這個(gè)問題，有如下建議：若患者年齡在45歲以下，軟骨缺損面積在2 cm2以內(nèi)，可采用微骨折術(shù)。若患者損傷面積大于2 cm2，由外傷或剝脫性骨軟骨炎引起，年齡在 15～55 歲之間，并且無系統(tǒng)性感染可進(jìn)行細(xì)胞移植療法。由于組織工程技術(shù)需要支架材料，治療費(fèi)用相對(duì)高，臨床效果好，不受缺損面積影響，術(shù)后需較長時(shí)間的康復(fù)訓(xùn)練，若患者能滿足相應(yīng)條件，可考慮使用。根據(jù)傳統(tǒng)理論，磨損的軟骨不能再生。經(jīng)過多年的研究和積累，促進(jìn)軟骨組織再生的方法逐步發(fā)展，取得了一定的成績，但目前修復(fù)軟骨缺損的臨床治療僅是姑息性的，還有許多問題有待解決。例如，影響軟骨再生的因素有哪些？修復(fù)的最佳材料是什么？體外培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞是否有惡性轉(zhuǎn)化的可能性，生物支架材料是否有毒性和致敏性，療效是否確定，如何建立組織工程軟骨產(chǎn)業(yè)化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。面對(duì)軟骨再生的困難和未來的挑戰(zhàn)，其臨床應(yīng)用前景受到廣泛關(guān)注。相信隨著多學(xué)科的融合，這些問題將逐漸得到解決，并將出現(xiàn)更多的軟骨再生新技術(shù)[67]。