miR-539通過抑素調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、遷移和凋亡

鐘敏華 吳展陵 李新軍 涂平華 楊英

1武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院呼吸科432100;2武漢科技大學(xué)430081

肺癌是常見的呼吸科惡性腫瘤，以非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)所占比例最高，大部分患者由于病灶局部發(fā)展或轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致病情無法痊愈甚至病死[1]。目前，手術(shù)是NSCLC患者最有效的治療手段，必要時(shí)聯(lián)合放化療。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNA 在慢性淋巴細(xì)胞白血病、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常[2]。另有文獻(xiàn)表明，miRNA 在細(xì)胞增殖分化、凋亡和浸潤等病理過程中發(fā)揮重要的作用[3]。廖立等[4]研究表明，miR-221、miR-98在肺癌組織中表達(dá)量較正常組織明顯增高;而miR-222、miR-155則明顯降低。抑素廣泛分布于多種生物組織和細(xì)胞中，經(jīng)證實(shí)，其在鼻咽癌、宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌癥組織中表達(dá)異常，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、病理分期等因素存在明顯關(guān)系[5]。有研究表明，肺鱗癌組織抑素表達(dá)量明顯增加，且分化程度越低則表達(dá)量越高[6]。因此，抑素在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，但關(guān)于其具體機(jī)制尚不清楚，故本文探討抑素在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2019年1月至2020年1月期間武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院收治的6例NSCLC 手術(shù)患者作為研究對(duì)象，并在切除術(shù)中采集標(biāo)本。標(biāo)本采集前通過武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (SW2017005)，并由患者簽署知情同意書。嚴(yán)格要求所有術(shù)中采集標(biāo)本未實(shí)施放化療，且在術(shù)后0.5 h內(nèi)置于液氮中保存。

1.2 方法 轉(zhuǎn)染Luc-anti-miR-539的細(xì)胞可抑制miR-539，作為低表達(dá)組。轉(zhuǎn)染Luc-anti-抑素可抑制抑素的表達(dá)，作為抑制抑素組。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，以轉(zhuǎn)染miR-539 的細(xì)胞為過表達(dá)組，比較2組miR-539、抑素的表達(dá)，驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)染成功。采用Hoechst核染色及EDU 標(biāo)記熒光免疫染色，通過RT-PCR 檢測(cè)抑制抑素組、過表達(dá)組、低表達(dá)組的miR-539 表達(dá)水平。CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.1 提取總RNA 從液氮中取組織，采用Tizol試劑提取總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度，當(dāng)A260/A280=1.8～2.1，則提示合格。使用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA 的完整性，當(dāng)亮度28S/18S比值＞2，則提示完整性良好。

1.2.2 miR-539定量測(cè)定 使用反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)，以U6 為內(nèi)參照物，U6 反 轉(zhuǎn) 錄 引 物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAc TGC-3′，正 向 引 物：5′-GGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物：5′-CAGTGAGGGTCCGAGGT-3′;利用反轉(zhuǎn)錄引物，把總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)體系為：10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5μl，100 nmol/L d NTPs 0.15μl，反轉(zhuǎn)錄酶1.0μl，RNase抑制劑0.19μl，總RNA 5.0μl，加DEPC水至15μl，輕輕混勻后，16℃，30 min;42℃，60 min;85℃，5 min;轉(zhuǎn)換反應(yīng)體系為：2×PCR 緩沖液10μl，20×miRNA-539特定引物和熒光探針1μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl，加DEPC水至20μl，置ABI 7500熒光PCR 儀上按照95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃45 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，4 ℃，保存采集數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.2.3 miR-539在NSCLC 中靶基因的篩選 利用生物信息學(xué)方法結(jié)合eDNA 微陣列檢測(cè)結(jié)果，在Pic Tar、TargetScan和miRBase Targets 3個(gè)數(shù)據(jù)庫中篩選miR-539的靶基因，且經(jīng)eDNA 微陣列檢測(cè)結(jié)果顯示在NSCLC (肺鱗癌和肺腺癌)中抑素基因表達(dá)上調(diào)。抑素基因m RNA 的3′UTR含有miR-539 的種子序列互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。利用PCR 擴(kuò)增含有此結(jié)合位點(diǎn)的片段，并克隆插入pcDNA3/EGFP 質(zhì)粒中EGFP 編碼區(qū)下游的Bam HIEcoRI位點(diǎn)。構(gòu)建完成的質(zhì)粒pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTR 經(jīng)Bam HI-EcoRI 酶 切 產(chǎn) 生234 bp的片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將抑素基因m RNA 的3′UTR 中miR-539種子序列結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的3個(gè)堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變后，克隆插入pcDNA3/EGFP質(zhì)粒中EGFP 編碼區(qū)下游的Bam HI-EcoRI位點(diǎn)。構(gòu)建完成的質(zhì)粒pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTRmut經(jīng)Bam HI-EcoRI酶切產(chǎn)生234 bp 的片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTR 質(zhì)粒與Luc-anti-miR-539共轉(zhuǎn)染Hoechst、EDU、Merge 細(xì)胞，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合NSCLC與正常組織基因表達(dá)譜差異的基因芯片分析，確定了抑素是miR-539的候選靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn);3組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-539 過表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移指標(biāo)的影響 在轉(zhuǎn)染24 h 后采用RT-PCR 測(cè)定miR-539表達(dá)量，過表達(dá)組抑素的m RNA 相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.07)，陰性對(duì)照組抑素的m RNA相對(duì)表達(dá)量為 (0.20±0.02)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.917，P ＜0.001)。過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力 (4.21±1.21)較陰性對(duì)照組 (8.09±0.97)降低(t=6.128，P ＜0.001)，見圖1。過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力[(514.28±36.14)個(gè)]較陰性對(duì)照組[(1 500.33±156.25)個(gè)]降低 (t=15.060，P ＜0.001)，見圖2。

圖1 CCK-8檢測(cè)過表達(dá)組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖曲線

圖2 過表達(dá)組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞遷移能力比較

2.2 miR-539 過表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡的影響 過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率 [(53.21±7.59)%]較陰性對(duì)照組 [(40.25±6.21)%]增高 (t=3.237，P =0.009)，見圖3。

2.3 抑素、miR-539 對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖指標(biāo)的影響 抑制抑素組 (11.32±0.36)和低表達(dá)組(9.03±0.28)的細(xì)胞增殖能力較過表達(dá)組(5.69±0.08)高(F =672.994，P ＜0.001)，進(jìn)一步組間比較的結(jié)果如下：抑制抑素組與低表達(dá)組細(xì)胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=30.603，P ＜0.01)，抑制抑素組與過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q =51.586，P ＜0.01)，低表達(dá)組與過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=20.983，P ＜0.05)，見圖4。

2.4 抑素、miR-539 對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡指標(biāo)的影響 抑制抑素組[(38.56±5.24)%]的細(xì)胞凋亡率較低表達(dá)組[(47.26±4.98)%]和過表達(dá)組[(58.61±6.32)%]低 (F =19.735，P ＜0.001)，進(jìn)一步組間比較的結(jié)果如下：抑制抑素組與低表達(dá)組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.844，P ＜0.05)，抑制抑素組與過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q =8.859，P ＜0.05)，低表達(dá)組與過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q =5.015，P ＜0.05)，見圖5。

圖3 過表達(dá)組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率 ×100

圖4 抑素、miR-539對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響

3 討論

miRNAs在癌癥組織中的表達(dá)及其作用逐漸被關(guān)注。miRNAs屬于非編碼的小分子單鏈RNA，長度約為19～25個(gè)核氨酸，通過靶點(diǎn)基因結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。同時(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)顯示，miRNAs在癌癥細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物過程發(fā)揮重要的作用[7]。另有文獻(xiàn)顯示，miRNAs對(duì)基因轉(zhuǎn)錄及腫瘤相關(guān)信號(hào)通路具有重要的調(diào)控作用，并可作為癌癥的藥物靶點(diǎn)[8]。因此，miRNAs在癌癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的角色。miRNAs主要包括抑癌基因和促癌基因，對(duì)腫瘤靶向治療藥物的研制有一定意義。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，miR-539表達(dá)失調(diào)與NSCLC細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡之間具有緊密的關(guān)系[9]。因此，探尋miR-539在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制可使患者在提高NSCLC 治療效果和生活質(zhì)量中受益。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，miR-539 在NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)與生存時(shí)間縮短具有緊密的關(guān)系，且表達(dá)下調(diào)的miR-539 通過促進(jìn)細(xì)胞增殖而參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展[10]。但關(guān)于miR-539通過抑素調(diào)控NSCLC的細(xì)胞增殖、遷移和凋亡機(jī)制研究較為罕見。

本研究結(jié)果顯示，miR-539在A549細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞，與相關(guān)研究結(jié)論相一致[11]。miRNA 是非編碼的短小RNA，其在調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、生長發(fā)育、免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮重要的作用，而miR-539可能作為抑癌基因而在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的意義。進(jìn)一步研究表明，NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-539后，miR-539表達(dá)明顯增高，細(xì)胞增殖和遷移能力明顯降低，細(xì)胞凋亡明顯增高。顧立學(xué)等[12]研究表明，miR-539 在甲狀腺瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，可通過靶向拮抗膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白1的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌癥細(xì)胞增殖和遷移。同時(shí)，張瓊等[13]研究表明，骨肉瘤MG-63細(xì)胞中，miR-539表達(dá)下調(diào)≥50 倍。因而miR-539通過靶向作用于鳥苷酸激酶蛋白的抑癌基因。結(jié)合本研究結(jié)果，miR-539可作為NSCLC 的抑癌基因而明顯抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合NSCLC 組織與正常組織基因表達(dá)譜差異的基因芯片分析，明確抑素為miR-539 的候選靶基因，采用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證抑素受到miR-539的直接調(diào)控。過表達(dá)miR-539 的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增高，而靶向抑制抑素、低表達(dá)miR-539的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞遷移率相對(duì)增高，細(xì)胞凋亡率相對(duì)降低，可見靶向抑制抑素及低表達(dá)miR-539可促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移，而抑制細(xì)胞凋亡;反之，過表達(dá)miR-539 可抑制細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。筆者認(rèn)為：miR-539是通過抑素調(diào)控NSCLC的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡。鄧學(xué)軍等[14]對(duì)凋亡相關(guān)基因的研究表明，轉(zhuǎn)染miR-539后抑癌基因和促凋亡基因表達(dá)明顯上調(diào)，而抗凋亡基因表達(dá)明顯下調(diào)，間接反映miR-539 可明顯增強(qiáng)癌癥細(xì)胞株對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的敏感性。因此，miR-539在NSCLC的細(xì)胞增殖遷移和凋亡中起到重要作用，并提示抑素參與其調(diào)控過程，為miR-539在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的功能及作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。抑素屬于抑癌基因，分布于線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)細(xì)胞生長分化和凋亡等生物過程發(fā)揮負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。miR-539、抑素在NSCLC組織中低表達(dá)，且細(xì)胞分化程度越低，其表達(dá)越高[15]。抑素是miR-539 的直接靶基因，miR-539通過上調(diào)抑素進(jìn)而對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡具有重要的調(diào)控作用。

圖5 抑制抑素組、低表達(dá)組和過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡比較 ×100

綜上所述，miR-539、抑素屬于抑癌基因，miR-539 過表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞增殖遷移，miR-539低表達(dá)或靶向抑制抑素可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移;miR-539 過表達(dá)可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miR-539低表達(dá)或靶向抑制抑素可明顯抑制細(xì)胞凋亡，miR-539可能通過抑素調(diào)控NSCLC 細(xì)胞增殖遷移和凋亡過程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突