臨床標本分離的絲狀真菌實驗室檢測與臨床特點分析

曹敬榮 王育英 謝威 王巖 陳典典 李文軍 劉云屹 閔嶸 王培昌

首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院檢驗科，北京100053

近年來，隨著免疫功能低下人群增加，侵襲性真菌，尤其絲狀真菌感染發(fā)病率逐年上升[1-3]，但由于真菌感染的臨床表現(xiàn)非特異和實驗室檢測技術(shù)有限，侵襲性絲狀真菌感染的診療面臨較大挑戰(zhàn)，患者預后差，病死率高[3-5]。尤其分離自呼吸道的絲狀真菌是定植/污染抑或感染受到臨床和實驗室人員的特別關(guān)注和重視。因此，本研究分析總結(jié)了首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院臨床分離的絲狀真菌患者實驗室檢測結(jié)果和臨床資料，以期為實驗室鑒定及臨床明確診斷、治療侵襲性絲狀真菌感染提供科學依據(jù)，報道如下。

1 對象與方法

1.1 感染標準 侵襲性真菌感染診斷標準參照我國《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則》[6]和2016 《年美國感染病學會曲霉病診斷處理實踐指南》[7]，診斷分為確診、臨床診斷和擬診。本研究診斷符合率以臨床診斷和確診病例進行分析，無菌體液中真菌培養(yǎng)陽性時需結(jié)合臨床排除標本污染。

1.2 臨床資料和菌株來源 回顧性分析2016年1月至2019年1月首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院各科室送檢標本分離出絲狀真菌患者的臨床資料和實驗室結(jié)果。每例患者多次分離相同菌株者只計入首次分離菌。本研究為回顧性分析，研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，該研究過程不會對人體發(fā)生任何接觸，不會對治療措施有改變。不會對患者本身產(chǎn)生風險，知情同意被放棄。研究中所有個人信息都在數(shù)據(jù)庫中加密，患者數(shù)據(jù)被去除標識，無侵犯隱私。

1.3 方法

1.3.1 分組與納入標準 根據(jù)絲狀真菌感染的診斷標準分為肺部感染組和定植/污染組，收集所有入選患者的臨床資料進行回顧性分析，包括年齡，性別，合并疾病 (如糖尿病、肺部疾病等)，糖皮質(zhì)激素，廣譜抗生素使用情況，抗真菌治療情況和預后等。同時分析絲狀真菌感染患者中死亡組與存活組的不同。

1.3.2 菌種分離培養(yǎng)及鑒定 將臨床送檢的呼吸道分泌物標本直接接種于沙保弱平板;組織標本研磨成勻漿后接種于沙保弱平板，置28℃孵箱培養(yǎng);血培養(yǎng)標本報警陽性后涂片鏡檢同時轉(zhuǎn)種沙保弱平板，置28℃和35℃培養(yǎng)，觀察生長菌落形態(tài)、顏色等特點，乳酸酚棉藍染色觀察菌絲、孢子和分生孢子形態(tài)、生長方式和顏色等，初步鑒定絲狀真菌菌屬，并經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(德國布魯克公司)鑒定絲狀真菌種屬。

1.3.3 G 試驗和GM 試驗檢測 試驗嚴格按照G試驗和GM 試驗試劑盒說明書操作。G 試驗 [丹娜(天津)生物科技股份公司]通過吸光度速率法測定真菌1,3-β葡聚糖含量，cut-off值＜37.5為陰性，＞90為陽性。GM 試驗(美國Bio-Rad公司)，采用雙抗體夾心法檢測血清或肺泡灌洗液中的半乳甘露聚糖含量，血清判定折點為≥0.5為陽性，肺泡灌洗液判定折點為≥1.0為陽性[8]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析?；颊叩哪挲g等為計量資料且呈正態(tài)分布，以±s 表示，2組間的比較采用成組設(shè)計資料的t檢驗;構(gòu)成比、檢出率等為計數(shù)資料，統(tǒng)計分析采用配對資料χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗或非參數(shù)檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料 共收集分離出絲狀真菌患者110例，男70例，女40例;年齡 (69.81±13.93)歲，年齡范圍為26～97 歲，≥60 歲占82.73%。確診絲狀真菌感染者70例，培養(yǎng)陽性與感染診斷符合率為63.64%，其中62例(56.36%)為肺部感染組;8例為耳道感染、角膜感染、傷口感染和血流感染;定植/污染組40 例 (36.36%)。肺部感染組患者年齡(70.03±12.41)歲，與定植/污染組患者年齡[(71.32±15.31)歲]相比，差異無統(tǒng)計學意義 (t=1.69，P =0.10)。肺部感染患者中≥60歲者51例 (82.26%)，感染病例主要集中于呼吸科、急診科和老年科。定植/污染組患者≥60歲者35例 (87.5%)，絲狀真菌主要分離自急診科、老年科和呼吸科。肺部感染組患者肺部疾病或雙肺受累、糖皮質(zhì)激素使用及合并糖尿病者顯著多于定植/污染組(P 值均＜0.05)。2組患者在年齡、性別、臨床表現(xiàn)和影像學表現(xiàn)方面差異均無統(tǒng)計學意義(P 值均＞0.05)，肺部感染組發(fā)熱患者多于定植/污染組 (χ2=10.736，P =0.001)。見表1。

2.2 絲狀真菌分布 臨床分離出絲狀真菌的標本主要來源于呼吸道 (92.73%，102/110)，其中痰液90例(81.82%)、肺泡灌洗液12例(10.91%);分離自眼角膜、耳道、傷口和血液分別為2.73%、1.82%、1.82%和0.91%。痰液中檢出菌種多為曲霉菌屬 (85.29%)，其中煙曲霉59.80%、黃曲霉12.75%，另外分離到構(gòu)巢曲霉、土曲霉、雜色曲霉和聚多曲霉等少見曲霉。耳道分泌物主要檢出菌種為曲霉菌屬，黑曲霉多見。角膜分泌物檢出絲狀真菌有鏈格孢菌屬、鐮刀霉和曲霉菌屬。傷口分泌物檢出毛孢子菌屬和接合菌屬。血液檢出1例層生鐮刀菌。肺部感染組和定植/污染組的菌種構(gòu)成均以曲霉菌為主，差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=0.410，P ＞0.05)，見表1。

2.3 肺部感染組患者預后分析 62例肺部絲狀真菌感染者中死亡22 例 (35.48%)，存活40 例(64.52%)。死亡組與存活組患者的性別比較差異無統(tǒng)計學意義 (χ2=0.01，P ＞0.05)，但死亡組患者年齡顯著高于存活組[(78.86±10.14)歲比(65.18±10.84)歲，t=4.83，P=0.01]。死亡組使用糖皮質(zhì)激素者顯著多于存活組(χ2=8.40，P ＜0.05)。但2組患者合并肺部疾病或肺受累、糖尿病及使用廣譜抗菌藥物方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P 值均＞0.05)。見表2。

2.4 G 試驗和GM 試驗結(jié)果 102例肺部分離出絲狀真菌患者均進行了G 試驗和GM 試驗檢測，其中G 試驗陽性56例 (54.90%)，GM 試驗陽性54例(52.94%)。肺部感染組G 試驗結(jié)果陽性54例(87.10%)，定植/污染組G 試驗陽性2 例(5.00%);肺部感染組中GM 試驗結(jié)果陽性52例(83.87%)，定 植/污 染 組GM 試 驗 陽 性2 例(5.00%)。肺曲霉感染患者血清中GM 含量顯著高于定植/污染患者(χ2=60.71，P =0.01)。

3 討論

近年來，由于人口老齡化增多，及糖皮質(zhì)激素、廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑在臨床的廣泛應用，絲狀真菌感染的發(fā)病率有明顯的上升趨勢[1-4]，已成為危重癥患者和免疫功能低下人群的主要死因之一。曲霉菌是條件致病性真菌，普遍存在于空氣和自然界中，曲霉菌孢子可通過呼吸道吸入肺部定植或?qū)е虑忠u性曲霉菌感染。不同部位感染侵襲性絲狀真菌種類不同[9-10]，臨床表現(xiàn)和預后亦不同。角膜分泌物和耳道分泌物臨床表現(xiàn)特殊，分泌物涂片多數(shù)可直接發(fā)現(xiàn)菌絲，診斷容易，通過抗真菌治療可較快取得療效。而呼吸道標本絲狀真菌分離陽性需要結(jié)合宿主因素、臨床特點等綜合分析，免疫功能正?；虻臀Ｋ拗鞫酁槎ㄖ?，而嚴重免疫缺陷者則會感染致病。

本研究中絲狀真菌分離最多為曲霉菌，占總分離數(shù)的81.82% (90/110)。其中煙曲霉占曲霉菌總數(shù)的90%，仍為主要的分離菌。但其它少見曲霉(如構(gòu)巢曲霉、土曲霉、雜色曲霉和聚多曲霉等)比例有所上升，與文獻報道煙曲霉是侵襲性曲霉病最常見的病原體一致[11-13]。本研究分離到的其它絲狀真菌包括鐮刀菌、青霉菌、賽多孢菌和接合菌等，可導致不同部位感染，對常用抗真菌藥物不敏感或耐藥，值得臨床重視。曲霉菌屬是肺部感染和定植最常見的絲狀真菌，分布科室以呼吸科、急診科、老年科等為主，此類科室多為年齡偏大、合并多種基礎(chǔ)疾病、免疫力相對低下患者，易吸入環(huán)境中曲霉孢子定植或感染有關(guān)。

表1 肺部感染組與定植/污染患者臨床資料與微生物學特點分析 [例 (%)]

表2 62例肺部感染絲狀真菌患者預后分析 [例 (%)]

結(jié)構(gòu)完整的氣道可有效防御曲霉菌定植，而肺部疾病患者氣道結(jié)構(gòu)破壞，可增加曲霉菌的定植和感染。有文獻顯示既往有COPD 和支氣管擴張癥等結(jié)構(gòu)破壞的呼吸道疾病是導致肺部絲狀真菌感染的重要危險因素[14-15]。本研究對肺部感染組和定植/污染組比較，合并肺部疾病或肺受累、使用糖皮質(zhì)激素及糖尿病的感染患者絲狀真菌分離率顯著高于定植組 (P 值均＜0.05)，與報道一致[10];而2組性別、年齡、腎功能不全等比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P 值均＞0.05)。死亡組與存活組相比，年齡和糖皮質(zhì)激素使用是導致死亡的主要危險因素，與文獻報道一致，提示臨床老年患者由于免疫力低下、基礎(chǔ)狀況差，易發(fā)生感染絲狀真菌且死亡風險大，應用糖皮質(zhì)激素會抑制巨噬細胞和單核細胞對曲霉孢子和菌絲的免疫[5，12]。因此，臨床對糖皮質(zhì)激素的使用要嚴格把握指征，避免濫用導致呼吸道真菌的定植、感染甚至死亡風險的增加。

本研究顯示，肺部感染組和定植/污染組患者臨床表現(xiàn)均有咳嗽、咳痰等不典型表現(xiàn)，2組影像學檢查均不特異，表明早期絲狀真菌感染診斷和治療困難。58.06%肺部感染組患者有發(fā)熱癥狀，顯著高于定植/污染組 (P ＜0.05)。提示臨床一旦出現(xiàn)發(fā)熱，需結(jié)合影像學、臨床其它表現(xiàn)等警惕是否由定植演變?yōu)榍忠u性感染的可能，及時送檢痰或肺泡灌洗液鏡檢和培養(yǎng)，并監(jiān)測G 試驗和GM 試驗，以便及早診斷和及時抗真菌治療。本研究中盡管診斷為肺部絲狀真菌感染患者均使用了抗真菌藥物治療，但病死率仍高達35.48%，顯著高于定植/污染組(P ＜0.05)，提示臨床一旦擬診應及早應用藥物及其他治療手段，減少延遲診治帶來的不良預后。

目前大多實驗室鑒定絲狀真菌最廣泛的方法仍為傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法[2，13，15]，但該方法依賴菌落生長時間和判讀者的經(jīng)驗，且對相似菌種無法鑒定到種。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜通過檢測真菌中特異性蛋白可快速、準確鑒定絲狀真菌。它正逐步應用于絲狀真菌的診斷和菌種分類[16]，能把常見的曲霉菌、鐮刀菌等準確鑒定到種復合體水平，但受限于數(shù)據(jù)庫信息有限及絲狀真菌不同生長階段特點 (菌絲大小、產(chǎn)孢情況等)和不同前處理提取蛋白方法。2016年美國感染病協(xié)會曲霉診療指南更新中，GM 檢測在診斷肺曲霉菌病中被強烈推薦，作為證據(jù)級別高的診斷方法[7]。目前已有報道GM、IgG/Ig A 等對肺部侵襲性曲霉菌感染有較好的診斷價值[18-19]。本研究對所有肺部分離絲狀真菌的患者均進行了G 試驗和GM 試驗檢測，結(jié)果顯示在絲狀真菌肺部感染患者中G 試驗和GM 試驗的陽性檢出率顯著高于定植/污染患者，尤其對于肺曲霉感染者，其血清中GM含量顯著高于定植/污染者 (χ2=60.71，P =0.01)，提示臨床聯(lián)合使用G 試驗和GM 試驗可提高曲霉菌的檢出率，對提示感染抑或定植/污染有重要意義。但G 試驗和GM 試驗不能確定絲狀真菌種類，且受影響因素多，臨床上應動態(tài)監(jiān)測減少假陽性率。

綜上所述，臨床分離培養(yǎng)出絲狀真菌后，一定要結(jié)合宿主因素，患者臨床表現(xiàn)，影像學檢查，相關(guān)的血清學檢查(G 試驗、GM 試驗)和病原學檢測。尤其來源于非無菌部位分離的絲狀真菌，應排除污染或定植。對可疑感染患者應及時多次送檢高質(zhì)量合格標本，提高絲狀真菌的陽性檢出率，以盡快明確診斷提高臨床治療的精確性，防止病情進展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突