抑制miR-134表達對幼鼠顳葉癲癇海馬神經元的保護作用及其機制

王娟 費世早 張玥 王晨 陳傳國 彭小壯 陳龍 王磊

癲癇是一種常見于兒童的神經系統疾病，經抗癲癇藥物治療后仍有20%～30%的患者發(fā)展為難治性癲癇，其中以顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)最為多見，成為臨床治療的難點[1]。TLE如未得到有效控制而反復發(fā)作可導致患者海馬神經元嚴重損傷及海馬硬化[2]。目前抗癲癇藥物主要以抑制神經元興奮性為主，但對TLE的療效欠佳。近年研究發(fā)現[3]，微小核糖核酸在癲癇發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其中微小核糖核酸-134(miR-134)具有調控神經元微觀組織結構的生物學功能，對局部神經回路的興奮性產生影響[4]。抑制miR-134表達可能發(fā)揮直接保護神經系統的作用[5]。研究結果顯示，神經細胞的存活主要依賴胞內磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidy linositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB；亦稱為Akt)信號通路的激活，故PI3K/Akt通路在TLE海馬神經元的存活中發(fā)揮重要作用[6]。本研究通過構建幼鼠TLE動物模型探討抑制miR-134表達對TLE海馬神經元保護作用，以及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物選取出生21 d的SD大鼠幼鼠40只，體質量平均為(50.5±4.6)g，雌雄各半，購自皖南醫(yī)學院動物實驗中心，由專人在清潔級動物房內飼養(yǎng)。根據數字表法將幼鼠隨機分為正常對照組、TLE模型組、miR-134抑制組、PI3K/Akt信號通路抑制劑組(以下簡稱“LY294002組”)，每組各10只，雌雄各半。本實驗操作符合動物實驗倫理規(guī)范要求。

1.2 主要試劑和儀器miR-134抑制劑購自上海吉瑪制藥有限公司，PI3K/Akt信號通路抑制劑(LY294002)購自美國Sigma公司，miR-134引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，神經元抗核抗體(Neu-N)及p-Akt、p70s6k、GSK-3β、Caspase-3羊抗鼠單克隆抗體購自北京中山生物技術有限公司，免疫組織化學、實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白質免疫印跡法(Western blot，WB)配套試劑盒均購自中國碧云天生物技術有限公司，電泳檢測儀及轉移槽購自北京菁美瑞科技有限公司，凝膠圖像成像分析系統購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1TLE造模：根據Levsque等[7]方法采用腹腔注射海人酸(kainic acid，KA)法構建TLE動物模型，KA注射劑量為按體重12 mg/kg。根據Racine[8]相關標準對造模進行分級：Ⅰ～Ⅱ級：輕型發(fā)作；Ⅲ級：中型發(fā)作；Ⅳ～Ⅴ級：重型發(fā)作。將Ⅳ級及以上癲癇發(fā)作定義為TLE造模成功，持續(xù)觀察2 h后按體重350 mg/kg給予水合氯醛腹腔注射終止癲癇發(fā)作。正常對照組幼鼠不做特殊處理。miR-134抑制組幼鼠于造模前30 min，給予側腦室注射miR-134抑制劑。簡要步驟為：按體重350 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉幼鼠，將頭固定在立體定位儀上，于幼鼠前囟后1 mm，旁開1.5 mm處鉆透顱骨組織，將微量注射器沿鉆孔垂直進入硬膜下4.0 mm部位處，緩慢注射5 μL miR-134抑制劑(20 ng/μL)至海馬CA1、CA3區(qū)，最后以生物膠封口處理并縫合皮膚組織。LY294002組幼鼠于模型前30 min給予側腦室注射5 μL miR-134抑制劑+5 μL LY294002至海馬區(qū)，濃度均為20 ng/μL。2周后處死幼鼠，取大腦海馬組織，制備勻漿液及組織切片。

1.3.2行為學檢測：TLE造模成功后采用Morris水迷宮檢測各組幼鼠行為學改變。(1)逃避潛伏期：反映幼鼠學習記憶能力，記錄從入水至爬上水下平臺的時間，每天檢測1次，連續(xù)5 d，取均值；(2)跨越次數：反映幼鼠空間記憶能力，記錄2 min內搜尋并穿越平臺區(qū)域的次數。

1.3.3miR-134表達水平：采用RT-PCR檢測幼鼠海馬組織miR-134表達水平。提取幼鼠海馬組織總RNA，采用逆轉錄方法合成cDNA，以U6為實驗內參，miR-134引物序列設計為：5′-GCGTACCAGAGGGAAAAAA-3′，5′-TGGGCCACCTAGTCACCAA-3′。實驗步驟按試劑盒說明書操作，采用2-△△CT法計算miR-134表達水平。

1.3.4海馬病理學檢測：采用HE染色海馬CA1、CA3區(qū)組織，置光學顯微鏡下進行攝片，觀察海馬病理學變化。

1.3.5Neu-N陽性細胞數檢測：采用免疫組織化學檢測各組幼鼠海馬CA1、CA3區(qū)組織Neu-N陽性細胞數。組織切片經常規(guī)方法脫蠟至水，采用5%(質量濃度)BSA溶液室溫封閉處理5 min，添加一抗(Neu-N濃度為1∶100)室溫孵育過夜并以PBS溶液洗滌3次，添加二抗于37℃溫度下孵育30 min，再次以PBS溶液洗滌3次，二氨基聯苯胺溶液顯色，常規(guī)固定，光學顯微鏡下攝片。觀察幼鼠海馬CA1和CA3區(qū)組織Neu-N陽性細胞數(呈棕黃色染色)，隨機選擇每只幼鼠6張切片計數陽性細胞，取均值。

1.3.6PI3K/Akt信號通路相關蛋白檢測：采用Western blot法法進行檢測。常規(guī)方法提取腦組織蛋白質，BCA法進行蛋白定量，上樣量50 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉移至PVDF膜，5%(質量濃度)脫脂牛奶室溫封閉2 h，根據PVDF膜面積加入一抗，除β-actin抗體濃度為1∶5000外，余濃度均為1∶500，4℃溫度條件下孵育過夜，PBS溶液清洗3～4次后，加入辣根過氧化酶-IgG(1∶2000)室溫孵育2 h，ECL顯色，在熒光凝膠成像系統中顯像，攝片，保存記錄。采用凝膠圖像處理系統分析p-Akt、p70s6k、GSK-3β、Caspase-3信號通路蛋白的相對表達量。

1.4 統計學處理采用SPSS 20.0進行統計學分析，對數據進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學檢測結果TLE模型組及LY294002組各死亡2只，miR-134抑制組死亡1只，正常對照組無死亡。與正常對照組比較，另3組逃避潛伏期均延長，跨越次數減少(均P<0.05)，miR-134抑制組幼鼠逃避潛伏期較TLE模型組和LY294002組縮短，跨越次數增加(均P<0.05)，而TLE模型組和LY294002組間逃避潛伏期、跨越次數比較無統計學差異(P>0.05)。結果見表1。

2.2 各組海馬miR-134表達與正常對照組比較，另3組海馬組織miR-134表達水平均升高(均P<0.05)，且miR-134抑制組、LY294002組海馬miR-134表達低于TLE模型組(均P<0.05)，而miR-134抑制組和LY294002組間比較無統計學差異(P<0.05)。具體結果見表1。

2.3 各組海馬組織病理學檢測正常對照組海馬CA1、CA3區(qū)組織結構未見異常；TLE模型組及LY294002組可見海馬CA1、CA3區(qū)神經元廣泛丟失，組織呈疏松水腫表現；miR-134抑制組CA1、CA3區(qū)組織結構及海馬神經元損傷程度較TLE模型組及LY294002組減輕(圖1)。

2.4 各組海馬組織Neu-N陽性細胞數比較與正常對照組比較，另3組海馬CA1、CA3區(qū)Neu-N陽性細胞數均減少(均P<0.05)，且miR-134抑制組Neu-N陽性細胞數高于TLE模型組及LY294002組(P<0.05)，而TLE模型組及LY294002組Neu-N陽性細胞數比較無統計學差異(P>0.05)。結果見表1、圖2。

表1 各組SD幼鼠Morris水迷宮以及海馬miR-134和Neu-N陽性細胞檢測結果

圖1 各組SD幼鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)病理學檢查結果(HE染色，×200)

圖2 各組SD幼鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)Neu-N陽性細胞表達比較(免疫組化，×100)

表2 各組SD幼鼠海馬PI3K/Akt信號通路相關蛋白相對表達水平比較

2.5 各組海馬PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達與正常對照組比較，另3組海馬p-Akt、p70s6k、GSK-3β、Caspase-3蛋白表達均升高(P<0.05)，且miR-134抑制組p-Akt、p70s6k、GSK-3β蛋白表達高于TLE模型組和LY294002組(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達低于TLE模型組和LY294002組(P<0.05)，而TLE模型組和LY294002組間上述蛋白表達比較無統計學差異(P>0.05)。結果見表2及圖3。

圖3 各組SD幼鼠海馬PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達(Western blot法)

3 討論

miR-134在神經元增殖分化、凋亡及微觀組織結構改變等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現[9]，幼鼠海馬神經元miR-134呈高表達，當miR-134表達明顯升高時可使神經元樹突棘呈粗短改變，影響神經元突觸的強度及可塑性。國外研究發(fā)現[10]，TLE患者及動物模型海馬組織miR-134表達水平均明顯升高，而注射miR-134抑制劑后可有效減少神經元破壞，具有抗癲癇作用[11]。針對癲癇持續(xù)狀態(tài)細胞模型的實驗亦發(fā)現其miR-134表達水平明顯升高，采用miR-134抑制劑作用后可明顯減輕神經元的高興奮性[12]。上述研究提示抑制海馬組織miR-134表達具有抗癲癇發(fā)生、保護神經元的生物學功能。但miR-134通過何種信號通路發(fā)揮保護TLE海馬神經元的作用仍不明確[13]。PI3K/Akt信號通路是目前國內外研究較多的促細胞存活的重要通路，其中PI3K家族在較多細胞存活、增殖及分化等生理過程中起關鍵性作用[14]。PI3K激活后可導致胞膜上肌醇出現磷酸化，合成釋放的第二信使結合并激活活化Akt及其他下游效應信號通路[15]。Akt是PI3K的直接下游作用靶點，正常情況下位于細胞質內，其活性表達主要通過PI3K的正性調節(jié)作用[16]。Akt磷酸化可直接或間接影響多種轉錄因子的表達及增強凋亡蛋白的活性功能，最終實現整個信號通路的生物學活性[17]。研究證實[18]，PI3K/Akt信號通路的生理功能是抑制細胞凋亡，但在癲癇疾病中可被異常激活活化，促進癲癇的形成。故作者推測miR-134可能通過PI3K/Akt信號通路對TLE海馬神經元產生作用。

本研究結果顯示，通過給予幼鼠側腦室注射miR-134抑制劑可有效抑制miR-134表達，行為學及病理學檢測均發(fā)現TLE幼鼠學習記憶能力、空間記憶能力下降程度及海馬區(qū)病理表現較正常對照組嚴重，且miR-134抑制組幼鼠行為學及病理學改變輕于TLE模型組及LY294002組，提示抑制miR-134表達可改善TLE幼鼠學習記憶能力、空間記憶能力及海馬區(qū)病理嚴重程度，而經LY294002干預的幼鼠未出現明顯改善；免疫組織化學檢測結果顯示，miR-134組海馬CA1、CA3區(qū)組織Neu-N陽性細胞數高于TLE模型組，而LY294002組其表達與模型組比較無統計學差異，表明抑制miR-134表達可有效保護海馬神經元；進一步對各組海馬組織PI3K/Akt信號通路相關蛋白進行檢測，結果表明抑制miR-134表達可導致p-Akt、p70s6k和GSK-3β明顯升高，而Caspase-3明顯下降，而應用LY294002處理后可阻止這種效應，提示其可能通過激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究結果顯示，抑制miR-134表達具有保護TLE幼鼠海馬神經元的作用，其作用機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關。關于miR-134是否同時還通過調控其他信號通路而發(fā)揮作用，尚需深入研究。