糖尿病大鼠模型視網(wǎng)膜VEGF 的變化研究

李 娜 孫先勇 高榮玉 徐鑫彥 婁華東（通訊作者） 山東省濰坊眼科醫(yī)院（山東，濰坊，261041）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）已經(jīng)成為國內(nèi)外糖尿病患者致盲的主要原因之一。 在臨床工作中，醫(yī)生重點關(guān)注增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療，對于背景期糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)注較少； 而一部分患者，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期即開始出現(xiàn)視力下降、黃斑水腫。VEGF 因子是目前重點治療的生物因子和藥物靶點， 該因子在DR 早期即已經(jīng)產(chǎn)生。 但是，VEGF 因子隨病程的變化以及對視網(wǎng)膜的影響如何研究較少。 本實驗擬通過大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型，研究VEGF 的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

采用健康6 周齡雄性SD 大鼠32 只， 體重為300-350g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。 本實驗所有操作及實驗動物的使用和飼養(yǎng)遵循NIH 頒布的實驗動物使用規(guī)范。 將入選實驗大鼠分為4組，分別為：空白對照組、糖尿病4 周組、糖尿病8周組、糖尿病12 周組。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病動物模型制作

以0.1mmol/L、pH4.4 的枸櫞酸緩沖液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鏈脲佐菌素（STZ）溶液，按照65mg/kg劑量進(jìn)行大鼠腹腔注射。 注射后4 天，自大鼠尾部采血，做血糖檢測，以高于16.67mmol/L 為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。 并觀察注射前后大鼠體重及飲食、飲水表現(xiàn)。

1.2.2 檢測方法

分別檢測空白對照組、4 周組、8 周組、12 周組的視網(wǎng)膜厚度、免疫熒光、免疫熒光雙重染色等的情況。

（1）視網(wǎng)膜厚度：用FFA 和OCT 一體機(jī)（Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT；德國Heidelberg 公司）對實驗鼠左眼進(jìn)行檢查。 大鼠稱體質(zhì)量后給予小劑量質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射（約50 mg/kg），雙眼用托吡卡胺滴眼液點眼擴(kuò)瞳，然后以甲基纖維素涂在角膜表面，保持角膜濕潤狀態(tài)。待大鼠反應(yīng)遲鈍后，包裹全身，置于OCT 檢查臺上，暴露待檢眼，使眼球前后徑線與掃描指示光源一致。 所有大鼠均使用Spectralis HRA+OCT 進(jìn)行FFA 和OCT 檢查。FFA 檢查時大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%熒光素鈉 （0.012ml/g）， 快速進(jìn)行視盤及上方、下方、鼻側(cè)、顳側(cè)、鼻上、鼻下、顳上、顳下視網(wǎng)膜9 個方位檢查；OCT 檢查時測量距離視盤上方、下方、鼻側(cè)、顳側(cè)2 個視盤直徑（disc diameter，DD）處的視網(wǎng)膜厚度。 使用檢測系統(tǒng)的自帶軟件手動測量視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE）高反射層定義為總視網(wǎng)膜厚度，然后測量內(nèi)界膜至外界膜之間的厚度，定義為內(nèi)外界膜間厚度。

免疫熒光染色：10%水合氯醛麻醉后， 摘除眼球。 將鼠眼固定于中性福爾馬林中48 小時，去除眼球前部及玻璃體，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明后常規(guī)浸蠟包埋處理，連續(xù)4um 切片。 切片脫蠟至水，3%H2O2－甲醇阻斷液阻斷10min，非免疫動物血清室溫孵育10min， 一抗分別以神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibriliary acid protein，GFAP）多克隆抗體（稀釋度1∶40，福州邁新公司）及VEGF 多克隆抗體（稀釋度1∶40，福州邁新公司）室溫孵育1 h，二抗以羊抗兔IgG-Cy3（稀釋度1∶80，武漢博士德公司）避光孵育40min。 磷酸鹽緩沖鹽水PBS 振蕩沖洗10min，激光共聚焦顯微鏡 （LSM880，ZEISS）536 nm 激發(fā)觀察、采集圖象。

免疫熒光雙重染色：滴加一抗分別為VEGF 鼠抗人單克隆抗體 （稀釋度1∶20， 福州邁新公司）；GFAP 兔多克隆抗體（稀釋度1∶40）37℃共孵育1h。二抗分別為：羊抗免IgG－Cy－3（稀釋度1∶50）；馬抗鼠IgG－FITC（稀釋度1∶20，武漢博士德公司）共孵育40min，其余步驟與免疫熒光染色相同。

1.2.3 結(jié)果判定免疫熒光染色：胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光為陽性。 免疫熒光雙重染色；GFAP 陽性細(xì)胞呈紅色熒光，VEGF 陽性細(xì)胞呈綠色熒光。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法確定各個時間點的數(shù)據(jù)與空白對照，比較其差別，分析其可能的影響因素。 不同組之間采用t 檢驗，以P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 制造模型成功后，測量大鼠的體重，在4 周時體重明顯下降，較對照組有明顯差異，P<0.05。

2.2 經(jīng)過HE 染色后，發(fā)現(xiàn)正常大鼠視網(wǎng)膜各層組織緊密，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常；糖尿病大鼠各層組織排列疏松，細(xì)胞間隙增大（見圖1）。測量厚度后發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠4 周時視網(wǎng)膜厚度無明顯變化，8周、12 周時厚度逐漸增大。 （見表1、圖2）。

圖1 箭頭示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞核增大、染色加深；星號示血管的管腔隨病程延長而擴(kuò)張。

表1 不同組大鼠視網(wǎng)膜厚度變化比較（±s）（μm）

表1 不同組大鼠視網(wǎng)膜厚度變化比較（±s）（μm）

眼數(shù)治療前后不同時間點空白對照組 DR4周 DR8周 DR12周8 120±1.45 140±1.15 160±2.38 150±3.41

2.3 免疫熒光染色： 在激光共聚焦顯微鏡下觀察，對照組的VEGF 主要出現(xiàn)在神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層；而在糖尿病大鼠中，VEGF 的標(biāo)記在視網(wǎng)膜各層細(xì)胞均有出現(xiàn)，主要出現(xiàn)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。 （見圖3）。

圖2 隨時間延長，各試驗組視網(wǎng)膜厚度增加。

圖3 箭頭示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，表現(xiàn)為胞核變小、軸突縮短；星號示血管，表現(xiàn)為血管管腔增寬。

2.4 GFAP 及VEGF 免疫熒光雙重標(biāo)記：對照組中，可被識別的細(xì)胞為Müller 細(xì)胞，主要局限在神經(jīng)纖維、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中；在4 周、8 周、12 周糖尿病大鼠中，Müller 細(xì)胞表達(dá)VEGF 明顯增加。 （見圖4）。

圖4 單箭頭示GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞，星號示血管，雙箭頭示muller細(xì)胞，紅色圖像示VEGF陽性，綠色示GFAP陽性。

3 討論

目前糖尿病患病率呈上升趨勢，2010 年患病率約為2.85 億，預(yù)計到2030 年將增至4.39 億。 糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，全世界約有9 300 萬人患有DR［1］。 臨床上，DR分為兩種形式：非增殖型DR （NPDR）和增殖型DR（PDR）［2］。 糖尿病性黃斑水腫（DME）和視網(wǎng)膜新生血管是糖尿病性黃斑水腫患者視力障礙和失明的主要原因。 其病理特征包括血管通透性增加、Bruch膜破裂、新生血管形成（NV）、毛細(xì)血管無灌注區(qū)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和死亡［3］。

本實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的延長，大鼠視網(wǎng)膜的厚度是逐步增加的，并且與糖尿病病程呈正相關(guān)性。這表明在早期DR 中，視網(wǎng)膜相關(guān)病理損害已開始出現(xiàn)，這也在后續(xù)的免疫實驗中得到證實。

據(jù)報道，VEGF 在血管發(fā)育、血管生成、細(xì)胞存活和炎癥中發(fā)揮著不同的作用。首先，VEGF 表達(dá)下調(diào)，在胚胎期和出生后血管發(fā)育過程中都被認(rèn)為是負(fù)調(diào)控因子［4，5］。 其次，VEGF 在一些原發(fā)性腫瘤和濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wet age-related macular，AMD）的實驗?zāi)Ｐ椭斜蛔C明是病理血管生成的積極調(diào)節(jié)因子［6］。 此外，VEGF 信號通路在調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞的趨化過程中發(fā)揮作用［7-9］。 本實驗中，糖尿病大鼠VEGF 的標(biāo)記在視網(wǎng)膜各層細(xì)胞均有出現(xiàn)，并隨著時間的增加，表達(dá)增加，這與相關(guān)報道是一致的［10-12］；同樣也證明了VEGF 在早期視網(wǎng)膜中即開始起到病理作用，是否在早期糖尿病視網(wǎng)膜病變中引起黃斑水腫還需要進(jìn)一步研究。

VEGF 表達(dá)上調(diào)后，主要引起視網(wǎng)膜血管損傷，通透性增加，炎癥物質(zhì)積聚［13］。 本實驗中，隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變病程的增加， 糖尿病8 周、12 周大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，證明隨著病程延長，視網(wǎng)膜病變在加重，可能與VEGF 持續(xù)高表達(dá)有關(guān)；免疫熒光實驗同樣發(fā)現(xiàn)，VEGF 主要在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層面表達(dá)，在此層面主要是視網(wǎng)膜血管層，而VEGF 的持續(xù)高表達(dá)，側(cè)面證實視網(wǎng)膜血管、結(jié)構(gòu)損傷，以及視網(wǎng)膜內(nèi)炎癥物質(zhì)的堆積。 糖尿病引起的生理生化的改變，是引起VEGF 高表達(dá)的因素［14-15］。

Müller 細(xì)胞貫穿于視網(wǎng)膜全層， 是主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本實驗中，采用GFAP 及VEGF 免疫熒光雙重標(biāo)記， 發(fā)現(xiàn)VEGF 主要表達(dá)在Müller 細(xì)胞，從而引起視網(wǎng)膜內(nèi)免疫環(huán)境的破壞，也進(jìn)一步表明視網(wǎng)膜功能破壞的開始。 Müller 細(xì)胞主要是通過旁分泌的形式引起視網(wǎng)膜內(nèi)免疫環(huán)境的變化，從而影響其他細(xì)胞的作用和功能，為進(jìn)一步引起形態(tài)的破壞創(chuàng)造了條件［16］。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，隨著病程的增加，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜厚度開始出現(xiàn)顯著變化，同時視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜血管的變化上。 免疫熒光及免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)VEGF 主要體現(xiàn)在神經(jīng)纖維層，同時在Müller 細(xì)胞中集中表達(dá)。 本實驗的缺點是僅從免疫方面證實了VEGF 隨病程發(fā)展可持續(xù)引起視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的改變，缺乏實際眼內(nèi)測量數(shù)據(jù)的支持，在后續(xù)實驗中繼續(xù)補(bǔ)充改進(jìn)。