牙齦卟啉單胞菌促進(jìn)模型鼠口腔鱗癌發(fā)展

劉其偉，焦葉林，陳 攀，阮豪杰，許海軍，谷變利，劉 軻，齊義軍，張旭明，高社干

90%以上口腔惡性腫瘤起源于鱗狀上皮細(xì)胞，因此，口腔癌主要指口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)。OSCC在最常見惡性腫瘤中排名第六，至少50%的OSCC起源于舌[1]。流行病學(xué)研究已鑒定了多個(gè)與OSCC相關(guān)的危險(xiǎn)因素，包括年齡、遺傳、飲食、抽煙、飲酒等，但確切的發(fā)病因素仍不清楚[2]。近年來，許多研究已證實(shí)細(xì)菌感染能夠增加某些腫瘤的罹患風(fēng)險(xiǎn)，如幽門螺桿菌和胃癌[3]，感染可使罹患胃癌風(fēng)險(xiǎn)增加2.7～12倍。人類口腔微生物組包括至少700種不同種類細(xì)菌，其中44%在體外分離培養(yǎng)并已命名，這些微生物構(gòu)成了復(fù)雜的口腔微生態(tài)[4]。正常生理狀態(tài)下，口腔微生態(tài)保持動態(tài)平衡，平衡紊亂可直接損傷鄰近組織或通過異常免疫反應(yīng)間接損傷遠(yuǎn)處組織，導(dǎo)致人體多種疾病發(fā)生發(fā)展?？谇晃⑸鷳B(tài)平衡紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前研究認(rèn)為口腔關(guān)鍵致病菌卟啉單胞菌屬和梭狀桿菌屬的數(shù)量異常增加是造成口腔局部微生態(tài)失衡的重要原因之一[5]。與相鄰非癌組織相比，OSCC組織中發(fā)現(xiàn)了大量卟啉單胞菌和梭狀桿菌屬的細(xì)菌。本研究鼠上頜磨牙進(jìn)行絲線結(jié)扎制備牙周炎，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4-NQO)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)共同作用誘導(dǎo)C56BL/6鼠OSCC發(fā)生發(fā)展[6]，探討P.gingivalis在鼠OSCC形成及進(jìn)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組24只6周齡、體質(zhì)量(19±0.5) g的C57BL/6雄鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。動物房溫度26 ℃，所有鼠適應(yīng)1周、4種抗生素聯(lián)合處理2周后，分為4組每組6只，分別為對照組、P.gingivalis誘導(dǎo)牙周炎組、4-NQO組、P.gingivalis誘導(dǎo)牙周炎和4-NQO聯(lián)合處理組。對照組鼠常規(guī)喂飼，第8至10周牙周炎組鼠上頜第二磨牙絲線結(jié)扎，每周2次P.gingivalis口腔涂抹感染誘導(dǎo)牙周炎；4-NQO組、4-NQO和P.gingivalis聯(lián)合組給予8周4-NQO處理(50 μg·mL-1)。所有鼠喂飼或處理至30周時(shí)，頸椎脫臼處死。

1.2 主要試劑配制4種抗生素聯(lián)合喂飼濃度：0.1 g·L-1萬古霉素，0.2 g·L-1甲硝唑、新霉素和氨芐青霉素；丙二醇配制4-NQO儲存液的濃度為5 mg·mL-1(4 ℃避光保存)。

1.3 制備C57BL/6鼠牙周炎6 μL·g-120%烏拉坦溶液(Sigma，貨號U2500-100G)通過鼠腹腔給藥，濃度為6 μL·g-1。鼠麻醉成功后，顯微鏡下絲線結(jié)扎鼠左右上頜第二磨牙，實(shí)驗(yàn)過程中如有絲線脫落，及時(shí)補(bǔ)扎。將對數(shù)生長期P.gingivalis細(xì)菌用2%羧甲基纖維素配制為2×1010·mL-1，每只鼠給予50 μL口腔涂抹，尤其是上頜磨牙區(qū)，每周2次，處理18周。

1.4 小鼠飼養(yǎng)及樣本采集整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中觀察記錄小鼠飲水進(jìn)食、體質(zhì)量、活動行為等變化，30周頸椎脫臼處死所有鼠，解剖分離舌組織，肉眼檢查記錄舌黏膜表面增生、感染、出血等病變后，福爾馬林溶液固定、常規(guī)脫水、包埋、切片，HE染色。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，小鼠體質(zhì)量變化比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 建模及實(shí)驗(yàn)方案為了闡明慢性感染在口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制，本研究結(jié)合小鼠牙周炎模型及4-NQO誘導(dǎo)口腔癌模型，設(shè)計(jì)了一個(gè)新方案(圖1-2)。小鼠按照以下方案進(jìn)行抗生素統(tǒng)一處理，8周4-NQO誘導(dǎo)，2周絲線結(jié)扎鼠上頜第二磨牙，隨后每周2次P.gingivalis感染，30周時(shí)統(tǒng)一處死小鼠進(jìn)行組織收集和數(shù)據(jù)分析。

圖1 口腔腫瘤誘導(dǎo)發(fā)生示意圖

圖2 鼠磨牙結(jié)扎制備牙周炎模型示意圖

2.2 實(shí)驗(yàn)過程中小鼠體質(zhì)量變化圖3顯示18、22、26、30周時(shí)各組小鼠的體質(zhì)量，其中對照組和P.gingivalis組在各時(shí)間點(diǎn)上平均體質(zhì)量變化不明顯，平均體質(zhì)量約為30 g。18周時(shí)4-NQO組和4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組體質(zhì)量開始下降，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，這兩組鼠體質(zhì)量逐漸降低。30周時(shí)鼠舌腫瘤明顯增大、影響進(jìn)食，處死各組小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)4-NQO組平均體質(zhì)量為23.67 g，4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組降低顯著、體質(zhì)量最輕，平均體質(zhì)量為22.55 g，與對照組和P.gingivalis組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖3 18、22、26周和30周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)鼠體質(zhì)量

2.3 舌表面變化隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展、4-NQO作用和P.gingivalis感染時(shí)間的延長，小鼠舌黏膜相繼出現(xiàn)白色斑塊、乳頭狀增生及菜花樣改變并逐漸增大，但4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠的病變較4-NQO單純處理組嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠舌黏膜全部可見不規(guī)則乳頭狀增生或菜花樣改變，4-NQO單純處理組僅有2只出現(xiàn)上述改變。對照組和P.gingivalis組鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，舌黏膜呈粉紅色、舌乳頭分布均勻，舌體柔軟，無白色斑塊及菜花樣改變。見圖4。

圖4 30周時(shí)小鼠舌體大體觀

2.4 舌組織學(xué)變化舌組織HE染色可見，30周時(shí)對照組和P.gingivalis組上皮完整，基底細(xì)胞大小均一、排列整齊，未見明顯細(xì)胞增生。4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠可見體積增大的癌細(xì)胞、排列不規(guī)則、異型性明顯，癌變細(xì)胞浸潤至舌肌全層。4-NQO聯(lián)合P.gingivalis組鼠的上述各種病變均較4-NQO單純處理組嚴(yán)重。見圖5。

圖5 30周時(shí)各組實(shí)驗(yàn)鼠舌組織學(xué)改變

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)，尤其是慢性炎癥，如慢性萎縮性胃炎、乙型或丙型肝炎[7-8]。在慢性炎癥病灶內(nèi)，存在大量的浸潤炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子等。這些炎性介質(zhì)不僅介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，更重要的是，它們還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和增殖[9]。眾所周知，P.gingivalis是口腔慢性牙周炎的關(guān)鍵致病菌，并與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。正常生理?xiàng)l件下與宿主和諧共生的微生態(tài)，在P.gingivalis存在的情況下，能夠轉(zhuǎn)化為具有致病性、紊亂的微生態(tài)[10]。P.gingivalis是革蘭氏陰性厭氧菌，主要寄生于牙周炎患者的齦下菌斑中，是牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis感染引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，通過炎癥細(xì)胞和炎癥因子的作用，損傷破壞牙周組織，慢性感染還導(dǎo)致牙槽骨吸收，最終使牙齒脫落[11]。雖然口腔是P.gingivalis常見的定植部位，其他多種組織中也能夠檢測到P.gingivalis，如咽喉、食管、肺、動脈粥樣硬化斑塊、阿爾茨海默病腦組織等[12]。這些結(jié)果表明，P.gingivalis能夠適應(yīng)多種組織微環(huán)境，通過多種機(jī)制逃逸炎癥反應(yīng)及免疫系統(tǒng)的殺傷作用。近年來多項(xiàng)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis與OSCC之間具有密切聯(lián)系[13]，提示P.gingivalis具有致癌潛能。

本課題組前期應(yīng)用qPCR和免疫組化分析了食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和癌旁組織中P.gingivalis的豐度，發(fā)現(xiàn)癌組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且癌組織中P.gingivalis富集程度與ESCC低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良具有明顯相關(guān)性[14]，提示P.gingivalis感染能夠促進(jìn)ESCC進(jìn)展。由于口腔和食管解剖位置毗鄰，組織結(jié)構(gòu)相同，于是設(shè)計(jì)本研究。本研究應(yīng)用4-NQO誘導(dǎo)的鼠口腔鱗癌模型進(jìn)一步證實(shí)了P.gingivalis能夠顯著縮短4-NQO誘導(dǎo)的鼠OSCC發(fā)生歷程，這些富集的P.gingivalis來源于鼠牙周炎中P.gingivalis感染。OSCC發(fā)生過程中，舌黏膜經(jīng)歷上皮異常增生、原位癌、浸潤性鱗癌等一系列連續(xù)的細(xì)胞表型和組織結(jié)構(gòu)的異常變化。隨著癌細(xì)胞惡性程度增加，原位癌繼續(xù)發(fā)展為浸潤癌，最終形成遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis能夠顯著促進(jìn)OSCC早期階段癌前病變的發(fā)生和進(jìn)展。通過飲水給予實(shí)驗(yàn)組鼠中等劑量的4-NQO(50 μg·mL-1)8周，其后20周正常喂飼[15]，30周時(shí)部分鼠舌黏膜發(fā)生病變(發(fā)病率33%)。然而，濃度為50 μg·mL-1的4-NQO預(yù)處理8周，再通過口腔牙周炎感染P.gingivalis，30周時(shí)P.gingivalis聯(lián)合4-NQO處理組鼠舌黏膜全部可見乳頭狀或菜花狀增生病灶(發(fā)病率100%)。由此可見，P.gingivalis明顯增加了鼠OSCC發(fā)病率，而4-NQO單獨(dú)處理組的鼠舌各種病變顯著低于聯(lián)合處理組。

本研究表明P.gingivalis引發(fā)的牙周炎促進(jìn)了4-NQO誘導(dǎo)的C57BL/6鼠舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，提示P.gingivalis是口腔癌發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一，深入探討P.gingivalis參與口腔癌變過程的分子機(jī)制，可為口腔癌的預(yù)防和靶向治療提供新途徑。