食管癌預(yù)后的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

閆錦陽，米優(yōu)嘉，李婉瑩，阮豪杰，耿聰聰，高社干

食管癌(esophageal cancer，EC)是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有惡性腫瘤的第六位。2015年中國(guó)食管癌發(fā)病人數(shù)預(yù)計(jì)為47.79萬人，同年有37.5萬人死亡[1]。EC常見有鱗癌和腺癌兩種亞型，西方主要常見腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)，而我國(guó)則以鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為主[2]。從輕度不典型增生至重度不典型增生，再至原位癌，最后成為侵襲性腫瘤，EC的發(fā)生是多種因素參與形成的復(fù)雜結(jié)果。盡管提倡早發(fā)現(xiàn)、早切除和多手段綜合治療，但大多數(shù)患者仍會(huì)經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的無癥狀期和診斷困難的早期階段，往往確診時(shí)已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致出現(xiàn)高死亡率，伴隨生活質(zhì)量低下。目前基于常規(guī)病理變量，如腫瘤大小、分級(jí)和腫瘤分期，預(yù)測(cè)EC患者預(yù)后主要憑借醫(yī)師豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)[3]，且受到一定個(gè)體異質(zhì)性的影響，故需要引用更加客觀的指標(biāo)幫助評(píng)估及管理患者[4]。一些生物標(biāo)記物(液體活檢、基因組學(xué)分子和蛋白質(zhì)組學(xué)分子)可以較容易從組織和/或體液中分離出來，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。以下回顧最新的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 與腫瘤增殖生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)

細(xì)胞異常增殖是惡性腫瘤的典型特征。一些生物分子信號(hào)導(dǎo)致正常食管上皮細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生異常，在腫瘤細(xì)胞增殖過程中扮演著重要角色。這些表達(dá)異常的分子和患者的預(yù)后緊密相連，有可能成為EC患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

Tang等[6]發(fā)現(xiàn)定位于11p15.5人染色體上的基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+感應(yīng)蛋白，表達(dá)水平與食管癌晚期分級(jí)呈正相關(guān)，刺激腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，有助于幫助預(yù)后判斷。有報(bào)道稱沉默厚體1(dickkopf-1，DKK1)作為一種致癌基因，其分泌蛋白可通過與細(xì)胞表面Ⅱ型跨膜蛋白CKAP4結(jié)合激活PI3K-AKT通路，從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖[7]。另外，富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)的過度表達(dá)提高腫瘤細(xì)胞的成瘤能力，其預(yù)后往往不佳[8]。相反，大腦表達(dá)X-連鎖基因1(the brain expressed x-linked gene 1，BEX1)的啟動(dòng)子出現(xiàn)高度甲基化調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)量明顯與腫瘤體積大小相關(guān)，可作為腫瘤潛在抑制因子來預(yù)測(cè)患者的生存期[9]。

非編碼RNA指不具有翻譯蛋白質(zhì)功能的RNA分子，包括Endo-siRNA、MicroRNAs、Piwi-interacting RNAs、Long noncoding RNAs、CircularRNAs等。MicroRNAs是一種長(zhǎng)度含有18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，通過抑制或者降解靶基因的表達(dá)起到調(diào)控作用，是參與細(xì)胞發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，不少研究認(rèn)為MiRNA失調(diào)參與許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)MiR-93-5p可通過外泌體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，作用于PTEN基因，促進(jìn)下游蛋白P21和Cyclin D1的過表達(dá)，導(dǎo)致受體細(xì)胞過度增殖。低表達(dá)的MiR-574-3p與食管癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)侵襲和預(yù)后密切相關(guān)，通過靶向作用于FAM3C和MAPK1蛋白調(diào)節(jié)PI3K/AKT及RAF/MEK/ERK兩大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制移植腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。過表達(dá)MiR-384通過抑制靶基因LIMK1，既阻斷腫瘤細(xì)胞進(jìn)入增殖活躍S期，又促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，體外實(shí)驗(yàn)再次證明上調(diào)MiR-384可減緩腫瘤及淋巴結(jié)的生長(zhǎng)速度和體積[12]。

長(zhǎng)鏈非編碼(long noncoding RNAs)是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它們多在轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮抑癌或促癌作用。目前公認(rèn)P53是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，不僅誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,還對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)[13]。沉默LncRNA AK001796可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，LncRNA AK001796通過調(diào)節(jié)MDM2/P53信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，可作為預(yù)后不良因素之一[14]。LncRNA 01617[15]、LncRNA CASC11均被發(fā)現(xiàn)在EC中高表達(dá)，加快細(xì)胞惡性增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生，且表達(dá)情況與患者預(yù)后緊密相關(guān)[16]。

2 與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)

EC轉(zhuǎn)移包含淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，是醫(yī)師及患者著重關(guān)注的疾病發(fā)展節(jié)點(diǎn)，預(yù)后結(jié)局往往不佳。因此需要尋找相關(guān)分子標(biāo)志物對(duì)患者病情進(jìn)行早期診斷和預(yù)后評(píng)估，進(jìn)而輔助臨床治療，幫助受益。

在腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中，上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一個(gè)重要現(xiàn)象。上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性、失去與基底膜連接等上皮表型特征，獲得間質(zhì)表型，可導(dǎo)致遷移能力和侵襲性增強(qiáng)，加速腫瘤轉(zhuǎn)移過程。EMT轉(zhuǎn)變過程中重要的核心調(diào)控因子包含Snail、Zeb1、Twist等等，其中，正常細(xì)胞內(nèi)Snail翻譯水平受到泛素化修飾并被核蛋白酶降解[17]。而去泛素化酶OTUB1[18]、PSMD14[19]均可介導(dǎo)Snail去泛素化過程維持其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能穩(wěn)定從而誘導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)EC腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，YAP(yes-associated protein)、CD44v9(CD44 variant 9)、IBSP(integrin binding sialoprotein)、 TCF21(transcription factor 21)也參與 EMT過程，起到正向或負(fù)向調(diào)控作用[20-23]。

Luo等[24]研究發(fā)現(xiàn)ADAM12-L屬于ADAMs家族，可參與局部粘連激酶(focal adhesion kinase；FAK)的激活，通過FAK/c-Jun軸進(jìn)一步增加其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，二者之間形成一個(gè)正反饋回路，不斷放大腫瘤細(xì)胞—基質(zhì)相互作用信號(hào)，導(dǎo)致食管癌具有高度侵襲性表型，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

TCF7L2(transcription factor 7-like 2)和早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1(early growth response 1，EGR1)通過ERK1/2依賴的途徑參與脂鈣蛋白2(high level expression of lipocalin 2，LCN2)的轉(zhuǎn)錄激活，增強(qiáng)轉(zhuǎn)移侵襲能力[25]。

非編碼RNA不僅參與腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控，在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中同樣發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Zhang等[26]的研究發(fā)現(xiàn)位于染色體11q13.3上的MiR-548k過表達(dá)與患者總生存期差相關(guān)聯(lián)，MiR-548k的特定區(qū)域可與ADAMTS1 MRNA的3′-UTR結(jié)合抑制其蛋白表達(dá)，游離VEGF-C的增加調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤組織淋巴細(xì)胞生成和淋巴轉(zhuǎn)移。相反，MiR-874-3p作為一種抑癌因子，作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抑制EC細(xì)胞發(fā)生遷移[27]。MiR-128-3p下調(diào)可靶向作用于ZEB1激活EMT過程，增加EC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[28]。在其啟動(dòng)子區(qū)域上含有CpG島的3種基因出現(xiàn)高度甲基化可介導(dǎo)抑癌因子MiR-124表達(dá)降低[29]。ESCC患者血清MiR-1290水平顯著升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物[30]。

近些年，一些研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CASC9、LncRNA DUXAP8、LncRNA 01296在食管癌組織中表達(dá)升高并促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)遷移的發(fā)展過程，生存分析提示預(yù)后不良[31-33]，需要更進(jìn)一步探究功能并闡明其分子機(jī)制。

3 與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)指標(biāo)

改善預(yù)后結(jié)局的重要途徑是根據(jù)病情給予評(píng)估，制定治療方案后，通過隨訪檢測(cè)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)臨床成像和分期工具，如COM-Puter斷層掃描、內(nèi)鏡和內(nèi)鏡超聲檢查在臨床應(yīng)用普遍，但靈敏度低也為診療帶來難度。

在初診和治療期間盡早發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞對(duì)預(yù)后判斷更具有優(yōu)勢(shì)。一項(xiàng)前瞻性研究報(bào)道外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)可作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。和骨髓播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cells，DTCs)相比，CTCs陽性狀態(tài)是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和整體生存期縮短的重要獨(dú)立因素[34]。針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)不詳?shù)牟∪?，評(píng)估CTCs狀態(tài)更有臨床價(jià)值，根據(jù)CTCs表達(dá)識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，可以進(jìn)一步強(qiáng)化多學(xué)科綜合治療來降低死亡率。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fibroblast growth factor 4，F(xiàn)GF4)是胚胎發(fā)育過程中的重要細(xì)胞因子，利用熒光原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)FGF4在食管癌組織中擴(kuò)增。FGF4擴(kuò)增與食管癌復(fù)發(fā)有關(guān)，是行根治性切除術(shù)后患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。尤其針對(duì)Ⅲ期患者，F(xiàn)GF4擴(kuò)增有助于風(fēng)險(xiǎn)分層，幫助醫(yī)師進(jìn)一步明確最佳治療策略。在未來，F(xiàn)GF4擴(kuò)增與臨床TNM分期的結(jié)合可能作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)ESCC患者5 a死亡和復(fù)發(fā)概率的預(yù)后模型[35]。

針對(duì)食管癌術(shù)后患者，Shinichi等[36]發(fā)現(xiàn)copine 5低表達(dá)組生存期較短，可成為監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的一項(xiàng)重要獨(dú)立指標(biāo)，尤其是局部復(fù)發(fā)者。Hayato等[37]認(rèn)為，黑色素瘤特異性抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAM)可能與其他基因協(xié)同作用促進(jìn)食管癌的血源性傳播，有望成為預(yù)測(cè)血源性復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。

4 與腫瘤耐藥有關(guān)指標(biāo)

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥是導(dǎo)致臨床治療效果不理想的主要原因之一。某些分子在腫瘤耐藥機(jī)制中發(fā)揮特殊作用，影響預(yù)后。

C-末端結(jié)合蛋白-2 (CtBP2)是一種與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子。CtBP2通過抑制促凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、activated caspase-3，增加Bcl-2抗凋亡蛋白水平來降低食管鱗癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的作用敏感性[38]。但該研究?jī)H針對(duì)單株細(xì)胞系，需要對(duì)其他類型EC細(xì)胞行進(jìn)一步研究證實(shí)。

ALC1，又名染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白1樣基因(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L)，屬于具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄功能的SNF-2類家族，是該家族中唯一具有致癌作用的基因[39]。沉默該基因可抑制腫瘤糖酵解過程，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)順鉑殺傷腫瘤細(xì)胞毒性作用。而沉默丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1α亞單位(pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit，PDHA1)基因則可促進(jìn)Warburg效應(yīng)，增強(qiáng)EC細(xì)胞惡性行為和耐藥性[40]。

5 與腫瘤免疫有關(guān)的標(biāo)志物

隨著腫瘤免疫相關(guān)理論的深入研究，基于免疫應(yīng)答的新型療法使腫瘤治療發(fā)生革命性轉(zhuǎn)變，對(duì)判斷預(yù)后具有指導(dǎo)意義。除PD-1及CTLA-4外，人們逐漸探索發(fā)現(xiàn)了新的免疫檢查點(diǎn)。

吲哚胺2，3-二加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO1)通過下調(diào)NK細(xì)胞受體及限制T細(xì)胞發(fā)揮功能，誘導(dǎo)食管癌發(fā)生免疫耐受反應(yīng)。Yuki等對(duì)305例行食管癌切除術(shù)患者的腫瘤組織行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)陽性組總體存活率、無病生存率明顯縮短，根據(jù)多因素模型IDO1陽性率與總死亡率升高呈顯著相關(guān)(HR=1.75，P=0.036)[41]。IDO1獨(dú)立于PD1/PDL-1途徑，可聯(lián)合其他靶點(diǎn)對(duì)治療、預(yù)后起指導(dǎo)作用。

B7-H6是B7家族的新成員，與NK細(xì)胞表面的活化受體NKp30結(jié)合激活TNF和IFN介導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[42]。91.72%ESCC組織中存在B7-H6蛋白表達(dá)，高表達(dá)患者生存差，可作為ESCC的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[43]。但該實(shí)驗(yàn)有一定的局限性，存在選擇偏倚及混雜偏倚，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)存在于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞[44]，與PD-1同被認(rèn)為是免疫抑制性受體[45]。一項(xiàng)研究報(bào)道稱LAG-3表達(dá)與腫瘤臨床分期顯著相關(guān)，高表達(dá)預(yù)示患者的預(yù)后較差，尤其對(duì)于判斷早期食管癌患者(T1-2、N0、Ⅰ～Ⅱ期)的臨床預(yù)后具有重要意義[46]。

6 單一標(biāo)志物預(yù)測(cè)生存期

易位融合基因AF1Q位于人體染色體1q21，可通過下游靶點(diǎn)WNT和STAT3促進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)展。對(duì)278例手術(shù)切除的EC標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)接受新輔助治療后AF1Q表達(dá)較高(P=0.0002)。根據(jù)Cox回歸分析顯示，在高表達(dá)患者中，疾病復(fù)發(fā)和疾病特異性死亡的風(fēng)險(xiǎn)要高出正常人1.5倍，是食管癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[47]。

利用全血行基因組DNA提取檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者染色體9p21上兩個(gè)鄰近的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因CDKN2A/2B發(fā)生遺傳變異，rs1333049位點(diǎn)多態(tài)性與預(yù)后不良明顯相關(guān)，CC基因型攜帶者總生存期明顯縮短[CC基因型(34.5±8.9)個(gè)月VS CG+GG基因型(47.7±5.9)個(gè)月，P=0.03][48]。

瞬時(shí)受體電位V型(transient receptor potential vanilloid，TRPV2)作為膜蛋白也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化影響腫瘤發(fā)展進(jìn)程。術(shù)前高表達(dá)TRPV2患者組，其5 a總生存率低于低表達(dá)組(59.5% VS 85.2%)，術(shù)后復(fù)發(fā)5 a生存率也明顯低于低表達(dá)組(46.6% VS 0.0%)，且統(tǒng)計(jì)學(xué)均有意義[49]。

單一標(biāo)志物的檢測(cè)過程雖然較為簡(jiǎn)單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)，但大多數(shù)單一腫瘤標(biāo)志物敏感性或特異性偏低，存在漏診和誤診的可能性，難以準(zhǔn)確反映腫瘤的復(fù)雜性。

7 多種標(biāo)志物組合預(yù)測(cè)生存期

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程涉及步驟多、機(jī)制復(fù)雜，一套組合生物標(biāo)志物可以更全面地評(píng)估患者預(yù)后。

Yu等[50]檢測(cè)PLCE1、IKBα和P53這3種蛋白在癌組織中普遍高表達(dá)，隨訪發(fā)現(xiàn)3種表達(dá)均呈陽性則總生存期短，預(yù)后差(P=0.009)。3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)建立的預(yù)后效能模型(AUC=0.624)可作為國(guó)際TNM分級(jí)評(píng)估預(yù)后(AUC=0.670)的完善與補(bǔ)充。

作為特殊的表觀遺傳修飾方式之一，含有賴氨酸殘基的組蛋白可通過高度甲基化參與染色體調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控等，其異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。如H4K20me3、 H3K9me3、 H3K36me3分別與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)侵犯和分期密切相關(guān)。與單一指標(biāo)相比，三者聯(lián)合應(yīng)用為評(píng)價(jià)ESCC患者預(yù)測(cè)預(yù)后指標(biāo)提供證據(jù)[51]。

8 總結(jié)

腫瘤細(xì)胞合成或分解產(chǎn)生的一些生物活性物質(zhì)，包括DNA片段、非編碼RNA、蛋白質(zhì)、酶、激素和代謝物等，均可作為生物標(biāo)志物。不同于內(nèi)鏡組織病理學(xué)及影像學(xué)手段，檢測(cè)生物標(biāo)志物作為非侵入性評(píng)估方式，避免給患者帶來不必要的疼痛及輻射。血漿腫瘤外泌體體外穩(wěn)定、易于收集，攜帶囊泡物質(zhì)含有大量生物學(xué)信息，特異度和敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物。MiRNA、LncRNA、ctDNA、CTCs等作為新興標(biāo)志物也能夠提供更多與腫瘤預(yù)后及治療相關(guān)的信息。

然而目前的研究結(jié)果多為小規(guī)模試驗(yàn)，部分生物標(biāo)記物的特異性和敏感性仍在爭(zhēng)論中，比起單一檢測(cè)某指標(biāo)，更傾向于多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估，在今后需要大規(guī)模、前瞻性的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)予以支持。

隨著對(duì)食管癌發(fā)展機(jī)制的研究，更多預(yù)后生物標(biāo)志物會(huì)被發(fā)現(xiàn)，指導(dǎo)臨床工作，使患者受益。