吉林和黑龍江兩省豬雞源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥檢測與優(yōu)勢基因型分析

王 琳，劉 娜，高玉斌，劉俊輝，張喜悅，王君瑋，曲志娜（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

β-內(nèi)酰胺類抗生素是獸醫(yī)臨床抗感染常用藥。由于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用，β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)并廣泛流行，多重耐藥現(xiàn)象嚴重[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）由質(zhì)粒編碼，能通過接合、轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo)等形式，使耐藥基因在細菌間擴散，可水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素[2]，從而導(dǎo)致細菌對該類藥物耐藥。目前已發(fā)現(xiàn)的ESBLs型已經(jīng)超過400種，且不同國家或地區(qū)流行的基因型和基因亞型存在差異[3]，主要為CTX-M型、TEM型、SHV型和OXA型等[4-5]。近年來的研究報道也顯示，在我國，CTX-M型產(chǎn)ESBLs菌株逐漸占主導(dǎo)地位[6]。本研究以2018年吉林和黑龍江兩省豬雞源大腸桿菌為研究對象，通過產(chǎn)ESBLs菌株的檢測、耐藥性分析及其耐藥基因研究，獲得產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥特征與優(yōu)勢基因型，以期為控制ESBLs菌株的快速傳播提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗菌株

210株大腸桿菌來自吉林?。ㄘi源50株、雞源51株）和黑龍江?。ㄘi源57株、雞源52株），于2018年4—7月從12個豬場和17個雞場的肛門/泄殖腔拭子中分離獲得；質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸桿菌ATCC 25922，均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心致病微生物監(jiān)測室保存、提供。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯、MH（Mueller-Hinton）肉湯、氯化鈉、GoTaq Green Master Mix酶、DL 1 000 DNA Marker、瓊脂糖，購自TaKaRa公司。

藥敏紙片包括，頭孢噻肟（CTX，30 μg/片），頭孢他啶（CAZ，30 μg/片），氨曲南（AZT，30 μg/片），頭孢曲松（CRO，30 μg/片），頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/Clav，30/10 μg/片），頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/Clav，30/10 μg/片），均購自北京天壇藥業(yè)生物技術(shù)開發(fā)公司。

96孔藥敏檢測板，含有青霉素類（氨芐西林）、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物類（阿莫西林/克拉維酸）、頭孢菌素類（頭孢噻呋、頭孢他啶）、氨基糖苷類（慶大霉素、大觀霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素）、氯霉素類（氟苯尼考）、磺胺類（磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明）、氟喹諾酮類（恩諾沙星、氧氟沙星）、多肽類（黏菌素）、碳青霉烯類（美羅培南）等14種藥物，均購自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

其他儀器包括：生物安全柜（HFsafe-1800），購自上海力申科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-I），購自天津市泰斯特儀器有限公司；可見分光光度計（722N），購自上海精密科學儀器有限公司；基因擴增儀（MLX-210），購自杭州博日科技有限公司；電泳儀（FR-180C），購自上海復(fù)日科技有限公司；凝膠成像分析儀（Tanon 2500BR），購自上海天能科技有限公司；小型冷凍離心機（CT 15RE，日立），旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱（1011A-2，日本），快速渦勻器（HYQ-2121A，SilentShake），比濁儀（OXOID）。

2 方法

2.1 ESBLs表型檢測

試驗具體操作步驟和判讀結(jié)果，按照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準進行，分為篩選試驗和確證試驗兩部分[7]。以肺炎克雷伯菌ATCC 700603作陽性對照，以大腸桿菌ATCC 25922作陰性對照。

2.2 藥敏試驗

根據(jù) CLSI標準，采用微量肉湯稀釋法測定210株大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC），以大腸桿菌ATCC 25922作為標準質(zhì)控。試驗菌的結(jié)果用敏感（S）、中敏（I）和耐藥（R）報告，對3類及以上抗菌藥物同時耐藥的菌株記為多重耐藥菌。

2.3 ESBLs基因型檢測

利用PCR方法檢測ESBLs常見基因型。引物[8-9]由擎科生物公司合成（表1）。將PCR擴增陽性產(chǎn)物送至擎科生物公司進行測序，并與NCBI進行序列比對，來確定目的基因型。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS軟件進行差異顯著性分析。P＜0.01，差異極顯著；P＜0.05，差異顯著；P＞0.05，差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 ESBLs表型檢測

210株大腸桿菌中，共檢出73株產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為34.76%（73/210）。73株產(chǎn)ESBLs菌株中：黑龍江省40株，檢出率為36.70%（40/109），吉林省33株，檢出率為32.67%（33/101），差異不顯著（P=0.54）；豬源17株（15.89%，17/107），雞源56株（54.37%，56/103），差異極顯著（P＜0.01）；兩省間的豬源（P=0.276）和雞源（P=0.061）產(chǎn)ESBLs菌株檢出率差異均不顯著。

表1 引物序列及目的片段大小

3.2 藥敏試驗

3.2.1 總體耐藥性 210株大腸桿菌對四環(huán)素（90.95%）和磺胺異噁唑（80.0%）最耐藥，其次對氨芐西林、復(fù)方新諾明和氟苯尼考，耐藥率均在60%以上，對頭孢他啶（7.62%）耐藥率最低。具體結(jié)果見表2。

3.2.1.1 不同動物來源對比 結(jié)果（表2）顯示：雞源大腸桿菌對13種藥物的耐藥率均比豬源高，其中對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、頭孢噻呋、頭孢他啶、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星和黏菌素等9種藥物耐藥差異極顯著（P＜0.01），對大觀霉素、磺胺異噁唑和復(fù)方新諾明3種藥物耐藥差異顯著（P＜0.05）。

3.2.1.2 不同地區(qū)對比 結(jié)果（表2）顯示：吉林省分離菌株對10種藥物的耐藥率高于黑龍江省，但僅對阿莫西林/克拉維酸、磺胺異噁唑和大觀霉素3種藥物的耐藥率顯著高于黑龍江省菌株（P＜0.05），而其他藥物兩省差異不顯著（P＞0.05）。

表2 210株大腸桿菌耐藥檢測結(jié)果及差異性分析

3.2.2 產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥比較產(chǎn)ESBLs菌株對13種藥物的耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs菌株，其中對阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、磺胺異噁唑、頭孢噻呋、頭孢他啶、氟苯尼考、恩諾沙星和氧氟沙星等8種藥物的耐藥差異極顯著（P＜0.01），對復(fù)方新諾明和黏菌素耐藥差異顯著（P＜0.05）。具體結(jié)果見表3。

3.2.2.1 不同動物來源對比 雞源產(chǎn)ESBLs菌株對慶大霉素和頭孢噻呋的耐藥率極顯著高于豬源（P＜0.01），對頭孢他啶和氟苯尼考的耐藥率顯著高于豬源（P＜0.05）。

3.2.2.2 不同地區(qū)對比 吉林和黑龍江兩省間，產(chǎn)ESBLs菌株除對阿莫西林/克拉維酸、黏菌素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥率差異顯著（P＜0.05）外，對其他藥物差異均不顯著（P＞0.05）。

3.2.3 不同來源多重耐藥比較 210株大腸桿菌分離菌株多重耐藥率為83.33%（175/210），其中豬源菌株多重耐藥率為77.57%（83/107），雞源菌株為89.32%（92/103），差異顯著（P=0.022）。雞源耐藥菌株主要集中在6～8耐，占70.87%；豬源耐藥菌株主要集中在3～5耐，占57.01%。經(jīng)卡方檢驗，兩種來源的6～8耐菌株占比差異極顯著（P＜0.01）。具體結(jié)果見表4。

3.2.4 產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥比較 產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率為98.63%（72/73），非產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率為75.18%（103/137），差異極顯著（P＜0.01）。產(chǎn)ESBLs菌株中，7耐、8耐最多，占58.90%；非產(chǎn)ESBLs菌株中，3耐、4耐最多，占38.69%。

3.2.4.1 不同來源對比 雞源產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率為100%（56/56），高于豬源產(chǎn)ESBLs菌株的94.12%（16/17），但差異不顯著（P=0.068）。

3.2.4.2 不同地區(qū)對比 吉林省產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率為100%（33/33），黑龍江省為97.50%（39/40），差異不顯著（P=0.360）。吉林省8耐菌株數(shù)最多，占36.36%（12/33），黑龍江省7耐菌株數(shù)最多，占45.0%（18/40）。兩省6～8耐菌株數(shù)差異不顯著（P=0.499），具體結(jié)果見表5。

表5 不同地區(qū)產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥檢測結(jié)果

3.2.5 ESBLs基因型檢測 73株產(chǎn)ESBLs菌株主要基因型為CTX-M型（97.26%，71/73），其次為TEM型（50.68%，37/73），OXA型僅在雞源中檢出（16.44%，12/73），兩種來源菌株均未檢出SHV型。經(jīng)卡方檢驗，雞源CTX-M型和OXA型檢出率（100%、21.43%）明顯高于豬源（88.24%、0），差異顯著（P＜0.01），而豬雞源TEM型檢出率差異不顯著（P=0.73）。兩省之間對于各基因型的檢出率均差異不顯著（P＜0.05）。具體結(jié)果見表6。

4 討論

4.1 豬雞源大腸桿菌耐藥情況

本研究結(jié)果顯示，210株大腸桿菌對四環(huán)素、磺胺異噁唑、氨芐西林、復(fù)方新諾明和氟苯尼考的耐藥率均在60%以上，且多重耐藥問題嚴重，多重耐藥率為83.88%。溫肖會等[10]對廣東省229株大腸桿菌進行試驗發(fā)現(xiàn)，229株大腸桿菌對四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨芐西林的耐藥率均在75%以上，且存在多重耐藥性，其中6株大腸桿菌可耐26種藥物；曾莉[5]對不同來源的大腸桿菌進行研究發(fā)現(xiàn)，試驗菌株對氨芐西林、復(fù)方新諾明和四環(huán)素耐藥率在70%以上；王志浩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，山東省336株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林和多西環(huán)素的耐藥率均達到78%以上；李鵬[12]研究發(fā)現(xiàn)，西藏地區(qū)大腸桿菌對四環(huán)素最耐藥，多重耐藥率為24.8%。以上研究說明，大腸桿菌對多種獸用抗菌藥物普遍產(chǎn)生耐藥性。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，吉林和黑龍江兩省雞源大腸桿菌比豬源耐藥嚴重，對12種藥物的耐藥率均顯著高于豬源，其中吉林省菌株對10種藥物的耐藥率均高于黑龍江省。由于樣品來源和監(jiān)測地點等不同，大腸桿菌會呈現(xiàn)不同耐藥特征，因此在實際生產(chǎn)中應(yīng)因地制宜，加強抗菌藥使用的監(jiān)督管理，尤其雞源生產(chǎn)中要規(guī)范藥物使用種類及用量，降低耐藥細菌的產(chǎn)生和傳播，以及由此導(dǎo)致的對人類健康的影響。

4.2 產(chǎn)ESBLs菌株流行及耐藥情況

ESBLs自報道以來在世界各地均有發(fā)現(xiàn)，我國各地也有檢出。馬馨等[13]報道，山西省雞源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率為68.33%；鄭新添等[14]報道，福建省龍巖市豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率為28.6%；曹敏等[15]報道，貴州省豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率為83.54%；坤清芳等[16]從四川省各地區(qū)的家兔養(yǎng)殖場中采集分離的97株大腸桿菌進行ESBLs表型檢測，結(jié)果有69株被確證為產(chǎn)ESBLs菌株，檢出率為71.13%。本試驗結(jié)果顯示，黑龍江省、吉林省產(chǎn)ESBLs菌株檢出率分別為36.70%、32.67%，差異不顯著，但豬源產(chǎn)ESBLs菌株檢出率（15.89%）顯著低于雞源（54.37%），說明產(chǎn)ESBLs大腸桿菌在不同地區(qū)、不同動物之間均有流行且存在差異。

表6 產(chǎn)ESBLs菌株基因型檢測結(jié)果與差異顯著分析

產(chǎn)ESBLs菌株比非產(chǎn)ESBLs菌株耐藥嚴重，且對不同作用機制的抗菌藥表現(xiàn)出更高水平的多重耐藥。薛原等[17]對黑龍江省哈爾濱市30株大腸桿菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率均比非產(chǎn)ESBLs菌株高；裴亞玲[18]對河南省雞源大腸桿菌進行檢測發(fā)現(xiàn)，35株雞源大腸桿菌中有22株為產(chǎn)ESBLs菌株，且產(chǎn)ESBLs菌株對15種抗菌藥的耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs菌株；坤清芳等[16]對四川省97株兔源大腸桿菌進行試驗，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率（100%）高于非產(chǎn)ESBLs菌株（85.71%），差異極顯著（P＜0.01）。本試驗中，產(chǎn)ESBLs菌株對13種藥物的耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs菌株，且雞源產(chǎn)ESBLs菌株對慶大霉素、頭孢噻呋的耐藥率極顯著高于豬源，產(chǎn)ESBLs菌株的多重耐藥率極顯著高于非產(chǎn)ESBLs菌株（75.18%），雞源產(chǎn)ESBLs菌株多重耐藥率高于豬源，從而進一步證實了產(chǎn)ESBLs多重耐藥菌株已在不同地區(qū)、不同來源的養(yǎng)殖場中廣泛流行。

4.3 ESBLs基因型與基因亞型分布情況

雖然產(chǎn)ESBLs菌株近年來在世界各地流行，但不同國家和地區(qū)之間流行的基因型仍存在明顯差異[19]。Fortini等[20]對分離自尼日利亞伊巴丹健康雞和豬的162株大腸桿菌進行試驗，發(fā)現(xiàn)所有菌株均攜帶TEM型基因；沈莉萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，上海市豬源產(chǎn)ESBLs菌株主要以CTX-M型居多，未檢出SHV和OXA型；Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，禽和豬養(yǎng)殖場產(chǎn)ESBLs菌株主要為CTX-M型。OXA型ESBLs主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中[23]，而在大腸桿菌中比較少見。SHV型在不同地區(qū)、不同動物源性大腸桿菌中檢出都較少。本試驗結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs菌株主要基因型為CTX-M型（97.26%），其次為TEM型（50.68%），OXA型僅在雞源中檢出，但在兩種動物來源的菌株中均未檢出SHV型，所以在養(yǎng)殖場日常管理中要防范耐藥基因的流行與傳播，加強規(guī)范用藥。