高遷移率族蛋白1在鈥激光致輸尿管狹窄患者中的作用及甘草酸苷的體外抑制研究

陳柯宇 王 亮

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，瀘州 646000)

鈥激光因具有精確切割、方向性好、止血、碎石效率高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)疾病，包括輸尿管碎石、尿道狹窄切開、腫瘤切除等。但是近年研究發(fā)現(xiàn)，鈥激光碎石術(shù)后可發(fā)生輸尿管黏連、狹窄甚至閉鎖，導(dǎo)致腎功能受損，發(fā)生率高達(dá)5.3%[1]。鈥激光致纖維化的機(jī)制尚不清楚，相應(yīng)的治療藥物仍然缺乏。高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)是一種廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白，可由壞死細(xì)胞被動釋放，也可由活化的炎癥細(xì)胞主動分泌[2,3]。進(jìn)入細(xì)胞外間質(zhì)的HMGB1在早期炎癥與晚期纖維化中發(fā)揮重要作用，阻斷HMGB1可以抑制纖維瘢痕的形成[4,5]。甘草酸苷是甘草根部提取的活性成分，也是HMGB1的特異性抑制劑，在一系列纖維化疾病中發(fā)揮治療效應(yīng)，包括特發(fā)性肺纖維化、腎間質(zhì)纖維化等[6-8]。綜上，本文旨在探討HMGB1在鈥激光致輸尿管狹窄患者中的作用及甘草酸苷的體外抑制效應(yīng)。

1 資料與方法

1.1資料 選取2016年3月至2019年1月我院收治的28例鈥激光致輸尿管狹窄患者作為研究對象。輸尿管狹窄均為輸尿管結(jié)石后行鈥激光碎石術(shù)導(dǎo)致，而且均經(jīng)泌尿系造影、三維CT、輸尿管鏡檢查確診。其中，男性19例，女性9例；年齡23～54歲，平均年齡38歲；17例為腰痛入院，11例為術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)；輸尿管上段狹窄8例，中段狹窄7例，下段狹窄13例。所有患者均在腹腔鏡下行輸尿管狹窄段切除，其中6例下段狹窄患者，因狹窄處距膀胱壁≤2 cm，需行膀胱輸尿管再植術(shù)，其他患者均行端端吻合術(shù)[9]。收集術(shù)中切除的輸尿管狹窄段組織，液氮速凍后保存。所有患者均簽署了知情同意書，本研究已獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1輸尿管組織中HMGB1與促炎、促纖維化因子水平的檢測 使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測輸尿管狹窄段組織中各因子mRNA水平，包括HMGB1、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)。具體步驟為：取術(shù)中切除的輸尿管狹窄段組織，剪碎后，在加有液氮的研缽中研磨成粉，使用Trizol Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司)提取組織中的總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后使用熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)擴(kuò)增目的基因。各基因的引物序列見表1，合成于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人輸尿管上皮SV-HUC-1細(xì)胞購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的F12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。根據(jù)鈥激光照射的能量值將SV-HUC-1細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即0 mJ、200 mJ、400 mJ、600 mJ、800 mJ，激光照射48 h后，檢測各組細(xì)胞HMGB1的表達(dá)量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇800 mJ鈥激光照射48 h 作為隨后實(shí)驗(yàn)的條件，將SV-HUC-1細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即對照組、鈥激光組、鈥激光+甘草酸苷組。對照組不給予鈥激光照射；鈥激光組給予800 mJ 鈥激光照射；鈥激光+甘草酸苷組給予800 mJ 鈥激光照射，并于照射后立即加入終濃度為10 μmol/L的甘草酸苷處理。

1.2.3Western blot檢測HMGB表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液充分裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。取40 μg總蛋白進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液4℃過夜孵育，各一抗稀釋度：HMGB1為1∶1 000、TLR4為1∶500、p-NFκB為1∶500、GAPDH為1∶2 000。洗滌后，加入二抗室溫孵育1 h，洗滌后顯色，凝膠成像儀下拍照。

1.2.4免疫熒光染色 收集各組細(xì)胞，加入多聚甲醛固定30 min，洗滌后加入5%的牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗稀釋液4℃過夜孵育，各一抗稀釋度均為1∶100。洗滌后，加入含有FITC或Cy3熒光標(biāo)簽的二抗37℃孵育30 min，洗滌后DAPI染色，洗滌后熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白的含量。

2 結(jié)果

2.1HMGB1表達(dá)與促炎、促纖維化因子水平的相關(guān)性 鈥激光致輸尿管狹窄患者的輸尿管組織qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：HMGB1 mRNA表達(dá)與IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 HMGB1表達(dá)與促炎、促纖維化因子水平的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between HMGB1 expression and proinflammatory,profibrotic factors

2.2不同能量的鈥激光照射對HMGB1表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示：隨著鈥激光照射能量的升高，HMGB1表達(dá)量逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 Western blot檢測HMGB1在不同能量鈥激光照射下的表達(dá)量Fig.2 Western blot was used to detect expression of HMGB1 irradiated by holmium laser with different energyNote:Compared with 0 mJ,*.P<0.05; compared with 200 mJ,#.P<0.05; compared with 400 mJ,△.P<0.05; compared with 600 mJ,&.P<0.05.

2.3各組細(xì)胞HMGB1及下游TLR4/NF-κB信號通路表達(dá)的比較 各組細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，鈥激光組細(xì)胞HMGB1熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與鈥激光組相比，鈥激光+甘草酸苷組細(xì)胞HMGB1熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖3)。

圖3 免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞HMGB1的表達(dá)與分布Fig.3 Immunofluorescence staining was used to detect expression and distribution of HMGB1 in cells of each group

各組細(xì)胞Westren blot檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，鈥激光組細(xì)胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鈥激光組相比，鈥激光+甘草酸苷組細(xì)胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖4)。

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞HMGB1及TLR4/NF-κB信號通路的表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expression of HMGB1 and TLR4/NF-κB signaling pathway in cells of each groupNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with holmium laser group,#.P<0.05.

2.4各組細(xì)胞炎癥及纖維化因子水平的比較 各組細(xì)胞上清ELISA檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，鈥激光組細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與鈥激光組相比，鈥激光+甘草酸苷組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 引物序列

2.5各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的比較 各組細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果顯示：與對照組相比，鈥激光組細(xì)胞E-cadherin熒光強(qiáng)度明顯減弱，Vimentin熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與鈥激光組相比，鈥激光+甘草酸苷組細(xì)胞E-cadherin熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，Vimentin熒光強(qiáng)度明顯減弱(圖5)。

表2 ELISA檢測各組細(xì)胞上清中相關(guān)因子的含量

圖5 免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞E-cadherin(綠色)和Vimentin(紅色)表達(dá)Fig.5 Immunofluorescence staining was used to detect expression of E-cadherin (green) and Vimentin (red) in cells of each group

3 討論

鈥激光在碎石的同時(shí)，其熱效應(yīng)也嚴(yán)重?fù)p傷正常的輸尿管組織，引起炎癥細(xì)胞浸潤、促炎因子釋放、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促纖維化因子分泌等病理變化，最終導(dǎo)致纖維瘢痕的形成。術(shù)后早期運(yùn)用卡托普利等藥物可以抑制膠原蛋白的沉積，降低狹窄的發(fā)生率，可見早期藥物干預(yù)的重要性[10]。但是，鈥激光致纖維化的機(jī)制仍不清楚，是目前開發(fā)針對性藥物的主要問題。

HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與修復(fù)，而在感染、機(jī)械應(yīng)力、熱效應(yīng)等刺激條件下可被動釋放至細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞也可遷移至損傷位點(diǎn)主動分泌HMGB1[11]。細(xì)胞外的HMGB1可與肺泡上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞等組織細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合，激活下游的NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥的級聯(lián)放大效應(yīng)，因此被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的促炎因子[12,13]。近年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1也與纖維化疾病密切相關(guān)，如肝纖維化、自發(fā)性肺纖維化、腎間質(zhì)纖維化等[14]。此外，抗HMGB1抗體被認(rèn)為在纖維化治療中具有一定的應(yīng)用前景[5]。鈥激光致輸尿管損傷的前期以炎癥反應(yīng)為主，晚期以纖維化進(jìn)程為主，因此本研究推測HMGB1可能在此病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并以此為切入點(diǎn)開展相關(guān)研究。

為了探討HMGB1與促炎、促纖維化因子的相關(guān)性，本研究首先選取鈥激光致輸尿管狹窄患者作為研究對象，收集輸尿管狹窄段切除術(shù)中獲取的狹窄段組織，qRT-PCR檢測HMGB1與各因子的mRNA水平，結(jié)果顯示隨著HMGB1 mRNA表達(dá)升高，促炎因子(IL-1β、TNF-α)及促纖維化因子(TGF-β1)mRNA水平也明顯升高，兩者呈正相關(guān)，表明HMGB1可能參與鈥激光導(dǎo)致的炎癥和纖維化過程。由于臨床上獲取正常輸尿管組織存在較大困難，本文未對狹窄段和正常組織間HMGB1水平進(jìn)行比較，因此上述結(jié)論仍需要更多的研究證據(jù)支持，未來可以通過構(gòu)建相關(guān)動物模型以驗(yàn)證結(jié)論。

甘草酸苷是中藥甘草中的活性成分，可通過阻斷HMGB1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等生物學(xué)效應(yīng)[15]。本研究構(gòu)建了鈥激光照射輸尿管上皮細(xì)胞的體外模型，結(jié)果表明HMGB1表達(dá)量具有照射劑量依賴效應(yīng)，為了更有效地研究甘草酸苷治療效應(yīng)，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇800 mJ鈥激光照射48 h作為條件。免疫熒光染色、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草酸苷可有效抑制HMGB1表達(dá)，進(jìn)而阻斷下游TLR4/NF-κB信號通路的激活，與其他研究報(bào)道相一致[16-18]。輸尿管上皮細(xì)胞在鈥激光照射下，炎癥及纖維化因子可不斷分泌，細(xì)胞外環(huán)境顯著改變，使細(xì)胞無法維持正常的上皮表型，而逐漸向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本文對細(xì)胞上清液中各因子含量及細(xì)胞表型分別進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示甘草酸苷可改善炎癥及纖維化因子分泌失衡的狀態(tài)，維持上皮細(xì)胞表型(E-cadherin)表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞表型(Vimentin)表達(dá)，表明甘草酸酐可有效抑制鈥激光導(dǎo)致的炎癥、纖維化及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。該結(jié)論既進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1在鈥激光致輸尿管損傷中的病理作用，又為鈥激光碎石術(shù)后早期應(yīng)用甘草酸苷提供了一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，在鈥激光致輸尿管狹窄患者的輸尿管組織中，HMGB1表達(dá)與促炎及促纖維化因子水平呈正相關(guān)。在鈥激光照射輸尿管上皮細(xì)胞的體外模型中，甘草酸苷可抑制HMGB1及其下游TLR4/NF-κB信號通路的激活，下調(diào)炎癥及纖維化因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。