CD49a分子研究進展①

張 彧 田志剛 孫 汭 鄭曉東

(中國科學技術大學免疫學研究所,合肥 230027)

1 CD49a概述

1.1CD49a的發(fā)現(xiàn)與沿革 1983年Hemler團隊發(fā)現(xiàn)，經絲裂原或者同種異體抗原刺激，活化的人T細胞表面存在分子量為210 kD與130 kD的糖蛋白復合物，且分子量為210 kD的糖蛋白僅表達于活化的T細胞表面[1]。該團隊后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該T細胞活化相關蛋白復合物的表達時相明顯晚于其他T細胞活化標志物，如CD25等，因此稱其為晚期活化抗原1(very late antigen-1，VLA-1)，以定義T細胞活化的“晚期”階段[2，3]。VLA為整聯(lián)蛋白的亞群，VLA-1的α鏈為整聯(lián)蛋白α1，于1989年在第四屆國際人類白細胞分化抗原大會上將其命名為CD49a。

1994年研究發(fā)現(xiàn)CD49a主要與細胞外基質(ECM)上的膠原蛋白Ⅳ結合，并于小鼠T細胞上發(fā)現(xiàn)了人VLA-1的同源分子[4，5]。1995年成功研制了CD49a的阻斷性單克隆抗體Ha31/8，廣泛應用于各種腫瘤及疾病模型研究[6]。同年首次發(fā)現(xiàn)CD49a在子宮蛻膜NK細胞上高表達[7]。1996年成功構建CD49a缺陷小鼠，其可正常發(fā)育分化，但會導致細胞黏附功能缺陷[8]。2003年成功研發(fā)CD49a的小分子選擇性抑制劑Obtustatin[9]。2013年作者所在實驗室發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟表達CD49a的NK細胞具有駐留特征，開創(chuàng)了CD49a作為組織駐留淋巴細胞生物標志物的新時代[10]。同年開展了CD49a的單克隆抗體用于關節(jié)炎治療的臨床試驗，2017年已完成Ⅱ期臨床試驗。

1.2CD49a的細胞表達譜 CD49a主要表達于神經細胞、間充質細胞、上皮組織細胞及多種腫瘤細胞表面，介導人骨髓間充質干細胞(MSCs)的發(fā)育和分化[11-16]。此外，CD49a也表達于NK細胞、T細胞、NKT細胞及巨噬細胞等多種免疫細胞，參與調節(jié)固有免疫和適應性免疫應答[17-22]。

1.3CD49a的分子結構 VLA蛋白家族由不同的α亞基與共同的β1亞基非共價結合組成[23]。VLA-1也稱α1β1，由210 kD的CD49a和130 kD的CD29 2個亞基組成異源二聚體[24]。CD49a為單次跨膜受體，胞外段共有1 100多個氨基酸殘基，包含1個約200個氨基酸的β螺旋結構域Ⅰ，在配體識別過程中發(fā)揮重要作用[25]。但CD49a胞內段僅有15個氨基酸殘基，其中的GFFKR序列在CD49a信號傳導方面起重要作用[26-28]。

1.4CD49a的信號傳導 CD49a與配體結合后，激活并介導細胞信號轉導，通過胞內段的GFFKR序列招募并磷酸化酪氨酸激酶Fyn，磷酸化Shc，并將Grb2/SOS復合物招募至細胞膜上，從而激活Ras-MEK-ERK激酶途徑，導致一系列轉錄因子激活以增強細胞的抗凋亡能力[8-10，29]。此外CD49a與配體膠原蛋白結合后，也可通過胞內段直接結合并激活T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TCPTP)，TCPTP通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化，進而抑制細胞增殖，但該途徑不會影響Ras-MEK-ERK激酶信號通路[30]。

1.5CD49a的家族分子與配體 在哺乳動物中，整聯(lián)蛋白由18種α亞基與8種β亞基非共價結合形成24種不同功能的異源二聚體[31]。VLA蛋白家族由不同的α亞基(α1-α6)和共用β1亞基非共價結合所組成，介導細胞對細胞外基質組分如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白的黏附[23，32]。CD49a主要配體為細胞外基質(ECM)上的膠原蛋白Ⅳ，親和力遠大于膠原蛋白Ⅰ，也可以與膠原蛋白Ⅸ、膠原蛋白ⅩⅢ、膠原蛋白ⅩⅥ及CD108(Semaphorin7A)結合從而傳遞胞內信號[5，33-36]。

1.6CD49a的基本功能 CD49a作為T細胞晚期活化抗原，表征T細胞的活化時相，在炎癥反應及調節(jié)生長分化方面具有重要作用，且可介導固有免疫和適應性免疫應答[10,21，22，37-39]。CD49a作為整聯(lián)蛋白，除起黏附作用外，也是組織駐留淋巴細胞的生物標志物。

2 CD49a的黏附功能與組織駐留的生物標志物

CD49a是黏附分子中整聯(lián)蛋白家族成員，與膠原蛋白結合后可使細胞黏附于細胞外基質，對細胞附著于組織局部起關鍵作用[40，41]。近年研究發(fā)現(xiàn)CD49a在多種組織駐留淋巴細胞上表達，為其重要的表面標志物。

2.1CD49a的黏附功能

2.1.1淋巴細胞的黏附 作為黏附分子，CD49a表達于多種活化的淋巴細胞。淋巴細胞可通過 CD49a與細胞外基質中的膠原蛋白Ⅳ結合而黏附于組織局部，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用[42]。采用抗體阻斷或敲除CD49a，可抑制此黏附作用，顯著降低組織局部的淋巴細胞數目，從而抑制其抗感染、抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)多種組織駐留淋巴細胞高表達CD49a，對其維持組織駐留特性至關重要，因而CD49a被認為是組織駐留淋巴細胞的標志性分子之一[10]。關節(jié)炎、炎性結腸病等自身免疫病中，病理性淋巴細胞通過CD49a黏附于關節(jié)滑膜或腸道黏膜引起免疫損傷。靶向阻斷CD49a，可降低炎癥部位的病理性淋巴細胞數量，延緩自身免疫病進程[42,43]。因此，靶向CD49a的治療策略為自身免疫病的治療提供新的思路。

2.1.2單核巨噬細胞的黏附 單核細胞和巨噬細胞上CD49a分子在靜息狀態(tài)下并不表達，但經刺激活化后開始表達。巨噬細胞上CD49a與膠原蛋白Ⅳ結合可抑制巨噬細胞游走，對巨噬細胞在炎癥部位的黏附具有重要作用，當使用CD49a阻斷抗體或CD49a缺陷小鼠體內可明顯增加炎癥部位巨噬細胞的遷出[44]。

2.2CD49a作為組織駐留淋巴細胞的重要標志 淋巴細胞通常被認為在全身各器官及血液中不斷循環(huán)，當組織局部發(fā)生炎癥或損傷時，淋巴細胞遷移至病變部位發(fā)揮功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種非淋巴組織中存在特殊表型及功能的淋巴細胞，被稱為組織駐留淋巴細胞，主要包括ILC、iNKT、γδT、MAIT、Trm等細胞，在轉錄因子、表型及功能等方面與循環(huán)淋巴細胞存在較大差異，從而可有效區(qū)分二者。這些淋巴細胞長期駐留于組織局部而幾乎不進入外周循環(huán)，在受到病原體入侵時，組織駐留淋巴細胞可迅速反應發(fā)揮免疫防御作用。

2.2.1天然免疫細胞 2013年作者所在實驗室首先界定了一群肝臟駐留NK(liver resident NK,LrNK)細胞，命名為肝臟ILC1。通過其獨特表型CD49a+NK1.1+CD49b-與經典NK細胞(conventi-onal NK,cNK,CD49a-NK1.1+CD49b+)進行區(qū)分，LrNK細胞駐留于肝臟組織，不隨血液循環(huán)進入外周循環(huán)，脫顆粒及分泌IFN-γ的能力較弱[10]。眾多研究者在子宮、唾液腺、脂肪、腎臟等器官或組織中均發(fā)現(xiàn)了CD49a+NK細胞，因而CD49a被認為是組織駐留NK細胞的標志性分子[45]。

ILC是重要的組織駐留淋巴細胞，存在于腸道、肺臟和脂肪等組織，對入侵病原體迅速反應，維持機體穩(wěn)態(tài)[46]。根據轉錄因子表達、細胞因子分泌及表面標志等指標可將ILC分為3個類型，即ILC1，ILC2和ILC3。幾乎所有的ILC1均表達CD49a，因而CD49a是區(qū)分ILC1與cNK細胞的重要表面標志之一[10]。文獻報道腸道NKp46+CCR6-和NKp46-CCR6-ILC3細胞均表達CD49a，而NKp46-CCR6+細胞則不表達CD49a，因而CD49a表達下降可能標志ILC3細胞由不成熟發(fā)展為成熟[47]。

2.2.2其他天然免疫淋巴細胞 iNKT細胞表達恒定TCRα鏈，識別由CD1d遞呈的脂質抗原。通常情況下iNKT細胞為非循環(huán)組織駐留細胞，優(yōu)先駐留于肝臟、脂肪、肺臟、腸道等外周淋巴器官，并表達CD49a、CD69等組織駐留相關標志物[48，49]。

γδT細胞于發(fā)育早期便向組織遷移，最終駐留于皮膚、呼吸道和小腸黏膜等黏膜組織中，對感染和腫瘤起免疫監(jiān)視作用[50-52]。組織駐留γδT細胞表達多種駐留相關分子如CD69、CD103和CD44等，靜息的γδT細胞不表達CD49a，但活化后高表達CD49a[5，53]。

MAIT細胞是非經典天然免疫T細胞，通過MR1(MHC-Ib-related protein 1)識別微生物抗原，高表達CD49a、CD69、CD103等組織駐留標志物，并傾向于駐留在腸道固有層[48，54]。

2.2.3獲得性免疫淋巴細胞 組織駐留記憶T(tissue-resident memory T,Trm)細胞是位于各組織的T細胞譜系，駐留于多種非淋巴組織(如腸道、腦、皮膚和肺臟)，保護外周組織[55-59]。Trm細胞在其駐留的組織中占據獨特位置，并呈現(xiàn)出樹突狀形態(tài)與循環(huán)的記憶T細胞區(qū)分[60]。研究表明，可通過CD49a表達差異區(qū)分Trm細胞亞群，如皮膚的CD49a+CD8+Trm能夠分泌大量IFN-γ及細胞毒顆粒，而不表達CD49a的CD8+Trm主要產生IL-17[57]。CD49a+CD4+Trm也具有類似的現(xiàn)象[61]。因此，表達 CD49a的Trm細胞功能更強[18,62-64]。

2.2.4CD49a作為組織駐留淋巴細胞生物標志的意義 不同的組織駐留淋巴細胞其表型各不相同，但大部分均特征性表達CD49a、CD103、CD69及CD44等分子(表1)。通過特征性分子和趨化因子受體的組合可定義組織駐留淋巴細胞的表型，并與外周循環(huán)淋巴細胞加以區(qū)分，如作者所在實驗室發(fā)現(xiàn)LrNK細胞表達CD49a、CXCR6等分子，并可與外周NK細胞區(qū)分[10]。

CD69是Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于C-型凝集素受體家族[65]，通常被認為是淋巴細胞活化的早期標志物。CD69在外周靜息淋巴細胞表面表達(約1%～7%)，但受外界刺激后表達水平迅速提高(約30%～90%)[66-68]。此外，CD69在胸腺細胞上也有較高表達(42%)[69]。CD103是整聯(lián)蛋白αEβ7的α鏈，作為E-鈣黏著蛋白受體介導細胞黏附，在外周淋巴細胞表面也有一定表達(約3%～4%)[67,70，71]。CD44是單次跨膜糖蛋白，為透明質酸受體，調節(jié)細胞-細胞和細胞-基質的黏附，表達譜較廣，在多種組織駐留淋巴細胞和外周循環(huán)淋巴細胞上均有表達，在外周靜息淋巴細胞上表達超過97%[72-74]。而CD49a在外周靜息淋巴細胞上幾乎不表達(<2%)，只在ILC1、Trm等多種組織駐留淋巴細胞有較高表達[10,71]。因此與其他組織駐留標志性分子相比，CD49a表達更為特異，更容易區(qū)分組織駐留與外周循環(huán)淋巴細胞。

表1 標志分子在不同組織駐留淋巴細胞的表達

3 CD49a的免疫學功能

CD49a不僅介導淋巴細胞黏附及組織駐留，還可調節(jié)免疫學應答。在不同類型或同一類型不同狀態(tài)的免疫細胞上，CD49a對免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用存在差異，有些細胞表現(xiàn)為更為活化的狀態(tài)，而另一些則處于更為抑制的狀態(tài)，但大部分研究認為CD49a表達的細胞處于更加活化的狀態(tài)。

3.1CD49a促進免疫系統(tǒng)活化 研究表明CD49a可活化T細胞、巨噬細胞及iNKT細胞，促進其分泌細胞因子，增強其抗凋亡及抗病毒能力等。

3.1.1T細胞 CD49a可促進 CD8+T細胞介導抗病毒及抗腫瘤免疫。靜息狀態(tài)的外周T細胞上幾乎不表達CD49a，而在流感病毒感染期間大多數外周CD8+T細胞開始表達CD49a，特別是在流感病毒特異性CD8+T細胞上高表達CD49a。隨著感染的消退，表達CD49a的抗原特異性CD8+T細胞具有更強的抗凋亡能力。二次感染中，大部分抗原特異性CD8+T細胞均表達CD49a，且CD49a對抗原特異性CD8+T細胞于肺部及其他非淋巴組織中的聚集發(fā)揮關鍵作用，用抗體阻斷CD49a可使肺部抗原特異性CD8+T的細胞數量顯著減少，從而減弱機體對病毒再次感染的清除能力[18]。此外，荷瘤小鼠接種腫瘤疫苗后，小鼠抗原特異性CD8+T細胞高表達CD49a，并歸巢于腫瘤部位呈現(xiàn)出更為活化的表型。使用抗體阻斷CD49a后，腫瘤生長加速，小鼠生存期明顯縮短[62-64]。

感染流感病毒后，CD4+T細胞開始表達CD49a，病毒清除后，氣道中CD49a+CD4+T細胞比例明顯升高。二次感染中，氣道中CD49a+CD4+T可分泌IFN-γ抵抗感染，提高細胞抗凋亡能力。

研究發(fā)現(xiàn)利用抗CD49a抗體可交聯(lián)γδT細胞表面的VLA-1，導致γδT細胞活化，促進IL-2受體表達[5]。作為T細胞活化晚期階段的標志，CD49a通常在T細胞活化的2～3周后表達[2]。無論是CD8+T、CD4+T還是γδT細胞，CD49a+細胞都具有更強的抗凋亡及清除病原體能力，提示這些細胞處于更為活化的狀態(tài)。

3.1.2巨噬細胞 肝臟內CD49a+巨噬細胞成熟和活化標志(如CD69、CD80、CD83、CD86等)的表達水平較CD49a-巨噬細胞更高，且TNF-α和IL-12的分泌能力更強，表現(xiàn)出M1型巨噬細胞表型，提示表達CD49a的巨噬細胞處于更為活化的狀態(tài)[22]。此外，巨噬細胞上CD49a與CD108的結合能夠激活巨噬細胞，增強其分泌IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的能力，加重自身免疫病，因而CD49a-CD108的識別作用可能成為某些自身免疫病的治療靶點[20,85]。

3.1.3iNKT細胞 iNKT細胞存在于多個組織，并具有組織駐留特性[49]。肝臟iNKT細胞高表達CD49a，而CD49a對NKT細胞介導炎癥發(fā)生尤其是分泌炎癥因子具有重要作用。ConA誘導的急性肝損傷中，CD49a+iNKT細胞分泌IFN-γ和IL-17A等炎癥因子的能力增強，介導肝臟炎癥及肝細胞壞死。敲除或阻斷CD49a可抑制iNKT細胞分泌IFN-γ和IL-17A，緩解肝臟損傷，因此，靶向CD49a可能是治療急性肝衰竭的新策略[19]。

3.2CD49a的免疫抑制功能 CD49a具有免疫抑制作用。在結核桿菌感染模型的CD8+T細胞及子宮蛻膜NK細胞中，CD49a表達往往伴隨細胞因子分泌降低和細胞毒性減弱，使免疫細胞處于抑制狀態(tài)。

3.2.1T細胞 抗原特異性CD8+T細胞在免疫應答的效應、擴增、衰退和記憶階段均持續(xù)高表達CD49a，CD49a負調控免疫應答衰退期抗原特異性CD8+T細胞的功能。結核桿菌感染中，CD49a既不介導抗原特異性CD8+T細胞遷移至肺部，也不參與記憶性T細胞維持，但在免疫應答的衰退階段，阻斷CD49a可促進抗原特異性CD8+T細胞分泌IFN-γ 并增強脫顆粒能力[86]。初次免疫衰退期和二次感染初期，CD49a反向調節(jié)抗原特異性CD8+T作用，可能由于T細胞所處時相不同，但具體機制尚需進一步研究[18]。

3.2.2蛻膜NK細胞 早期蛻膜組織中NK細胞占淋巴細胞總數的70%以上，超過85%的NK細胞表達CD49a。與外周血NK細胞相比，蛻膜NK細胞表達更高水平的CD49a并伴隨細胞毒性減弱[87-89]。利用抗體阻斷CD49a后，蛻膜NK細胞遷移和黏附能力下降而細胞殺傷能力明顯上升。此外，復發(fā)性自然流產患者的蛻膜NK細胞CD49a表達水平較低，但穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ表達顯著提高[39]。因此CD49a可使蛻膜NK細胞處于免疫抑制狀態(tài)，維持正常妊娠的免疫耐受狀態(tài)。

3.2.3ILC1 Peng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與經典NK細胞(CD49a-CD49b+)相比，小鼠肝臟CD49a+NK(即ILC1)細胞脫顆粒及分泌IFN-γ的能力較弱。LCMV病毒感染時，ILC1可通過高表達PD-L1抑制T細胞的抗病毒功能，發(fā)揮免疫負調作用[90]。與此類似，在TGF-β作用下，腫瘤浸潤的NK細胞(NKp46+CD49a-CD49b+)表面CD49a表達逐漸提高，最終轉化為ILC1(NKp46+CD49a+CD49b-)，而腫瘤組織浸潤的ILC1無法有效抑制腫瘤生長。隨腫瘤體積增大，腫瘤浸潤NK細胞比例逐漸降低，而ILC1比例提升并與腫瘤不良預后呈正相關[91]。ILC1高表達CTLA-4、CD96和LAG-3等免疫抑制分子，呈現(xiàn)出“耗竭”的表型，且ILC1 IFN-γ能力分泌下降、細胞毒活性降低、血管內皮生長因子(VEGF)分泌增加，對IL-2治療幾乎無響應[17，92]。因此，ILC1負調控機體的抗腫瘤免疫應答，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。

4 CD49a的其他生物學作用

CD49a除表達于免疫細胞外，在血管內皮及腫瘤細胞上亦有表達。腫瘤細胞CD49a表達可增強腫瘤細胞的耐藥性、抗凋亡及壞死能力[93]。血管內皮細胞表達CD49a可促進腫瘤周圍血管生成，導致腫瘤生長及轉移。

4.1促進腫瘤血管生成 研究發(fā)現(xiàn)CD49a與腫瘤組織微血管生成密切相關，VEGF是血管生成必需的細胞因子，腫瘤需在VEGF作用下生成大量新血管，最大限度獲取營養(yǎng)物質以滿足其生長需求[94,95]。VEGF可誘導血管內皮細胞表達CD49a，CD49a增強VEGF對血管內皮細胞的活化作用，促進血管生成。使用抗體阻斷CD49a可降低VEGF對血管內皮細胞的活化作用，抑制腫瘤周圍血管生成[96]。此外，CD49a還可通過抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)合成促進腫瘤血管生成。Cd49a-/-小鼠的血管內皮細胞中MMP7和MMP9顯著增加，通過降解纖溶酶原產生血管生成抑制素，抑制血管內皮細胞增殖。對Cd49a-/-小鼠進行荷瘤發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織的血管數量和管徑均明顯降低，腫瘤體積明顯減小，血漿MMP9濃度與腫瘤生長呈負相關[97]。

4.2促進腫瘤細胞原位生長及轉移

4.2.1原位生長 CD49a在黑素瘤、胃癌細胞、結直腸癌、胰腺癌等腫瘤細胞高表達，對腫瘤細胞存活和增殖起重要作用[15,98]。使用抗體阻斷或敲低CD49a，腫瘤細胞凋亡和壞死顯著增加，腫瘤周圍血管生成減少，腫瘤生長被抑制，表明CD49a對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

4.2.2腫瘤轉移 腫瘤細胞附著于富含膠原纖維的微環(huán)境是腫瘤細胞轉移的前提。腫瘤細胞表面CD49a與細胞外層黏連蛋白、膠原蛋白等結合可介導腫瘤侵襲。研究發(fā)現(xiàn)CD49a可上調腫瘤細胞MMP3表達，而MMP3是多種腫瘤侵襲的必需物質，阻斷CD49a可顯著抑制腫瘤侵襲及轉移[15,98-100]。因此，CD49a與腫瘤細胞的增殖、存活和轉移密切相關，是腫瘤患者預后不良的指標之一[101-103]。

5 展望

CD49a分子首次被鑒定于活化的T細胞，隨后發(fā)現(xiàn)其可表達于免疫細胞、內皮細胞及腫瘤細胞等多種細胞表面[2，10，14，15，18，22，97]。CD49a分子主要與膠原蛋白結合發(fā)揮黏附分子作用，對淋巴細胞及單核巨噬細胞在組織的黏附具有重要作用。CD49a作為免疫細胞組織駐留的生物標志物，在NK細胞、ILC、iNKT細胞、γδT細胞和Trm細胞均有表達，對免疫細胞發(fā)揮正調或負調作用。CD49a表達使巨噬細胞及二次免疫的組織駐留記憶T細胞更為活化，增強機體抵御病原體入侵的能力。免疫應答衰退期，CD49a表達可降低T細胞分泌細胞因子及脫顆粒能力，使細胞處于抑制狀態(tài)。CD49a+NK細胞高表達抑制性分子，但殺傷和分泌細胞因子能力較弱。此外，CD49a在腫瘤細胞及血管內皮細胞表達，可促進腫瘤細胞增殖及轉移，加速腫瘤發(fā)生發(fā)展。

根據CD49a在細胞黏附及組織駐留方面的特性而申請其治療自身免疫性疾病的臨床試驗正在開展，治療類風濕關節(jié)炎的Ⅱ期臨床試驗已結束。不同疾病中，CD49a對不同病原體及免疫應答不同階段所發(fā)揮的免疫調節(jié)作用具有一定差異，具體機制仍需進一步研究。CD49a可通過多種機制促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，為腫瘤檢查點的生物治療提供新靶點。綜上所述，針對CD49a或其配體的阻斷抗體的臨床研究，聯(lián)合放化療或其他免疫治療的治療方案的深入探討，都可能成為腫瘤或自身免疫病治療的新方向。