WNK1基因rs11611246位點多態(tài)性與云南漢族兒童急性淋巴細胞白血病關(guān)聯(lián)性研究①

武 坤 蘇艷丹 楊金榮 王雪嬌 曾 云⑥

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，昆明 650032)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是1～14歲兒童最多發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病機制復(fù)雜、惡性程度高，傳統(tǒng)“形態(tài)學(xué)-免疫學(xué)-病理學(xué)”觀點認為ALL發(fā)病涉及眾多信號傳遞通路改變[1]。隨著分子生物學(xué)理論、技術(shù)的發(fā)展，加之流行病學(xué)調(diào)查佐證，發(fā)現(xiàn)ALL可能與特殊環(huán)境暴露及多種遺傳因子變化有密切關(guān)系，部分基因多態(tài)性可能在ALL發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[2-4]。賴氨酸缺乏激酶1(WNK1)主要存在于高等哺乳動物體內(nèi)，是WNK家族主要成員，由位于12號染色體上一段150 kb的基因組序列指導(dǎo)合成，含有28個外顯子及多個轉(zhuǎn)錄起始位點。WNK1在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞增殖、活化、遷移等方面具有重要作用，通過磷酸化有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)調(diào)控MAPK級聯(lián)反應(yīng)可能參與腫瘤發(fā)病[5]。WNK1存在多個基因多態(tài)性位點，其不同變異也與多種疾病相關(guān)，但WNK1基因多態(tài)性與ALL有無相關(guān)性目前尚未見報道，本研究選擇WNK1基因rs11611246位點進行多態(tài)性分析，探討其與ALL易感性、環(huán)境交互作用及預(yù)后關(guān)聯(lián)性，以期為ALL發(fā)病機制研究、治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選擇2012年1月～2014年1月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科收治的初診漢族ALL患兒86例為研究對象，均常住于云南，其中男49例，女37例，年齡1～14歲，中位年齡4歲。診斷標準：所有患兒臨床表現(xiàn)、外周血常規(guī)及骨髓指標等相關(guān)檢查均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會血液學(xué)組關(guān)于ALL制訂的診斷標準[6]。排除標準：①骨髓增生異常綜合征、再生性障礙性貧血等其他血液系統(tǒng)疾??；②合并唐氏綜合征等遺傳疾病患兒。隨訪時間22～72個月。選擇同期健康漢族兒童95例為對照組，均常住云南，其中男55例，女40例，年齡1～14歲，中位年齡4歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會支持，所有患兒及對照組家屬均知情同意。

1.1.2儀器與試劑 DNA抽提試劑盒，北京艾德萊生物公司(中國)；PCR擴增儀、TaqMan-MGB Universal PCR試劑盒(批號：A15299)、TaqMan-MGB等位基因分型試劑盒(批號：A12303)，Applied Biosystems公司(美國)；引物合成：上海生物工程有限公司(中國)；兔抗人WNK1單克隆抗體(批號：ab137687)，Abcam公司(美國)；兔抗人β-actin抗體(批號：AF0003)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(批號：A0208)，碧云天生物公司(中國)。

1.1.3環(huán)境暴露資料 環(huán)境暴露主要包括：出生后居室裝修、放射性物質(zhì)接觸史(放療、核素治療，或X光照射、CT等影像學(xué)檢查，其中發(fā)病前1年內(nèi)影像學(xué)檢查為有效放射性物質(zhì)接觸)、化學(xué)性物質(zhì)接觸史(化肥、汽油、殺蟲劑、農(nóng)藥等)、住房500 m內(nèi)有工廠，這些資料被認為是白血病最主要的室內(nèi)、室外致病環(huán)境因素[2]。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 ALL患兒與健康兒童均取空腹靜脈血標本2 ml(EDTA抗凝)，保存于-20℃冰箱待測。采用外周血全基因組DNA抽提試劑盒(北京艾德萊生物公司)提取標本總DNA，嚴格按照試劑盒操作說明書設(shè)定的反應(yīng)條件及操作步驟進行，分光光度儀測定總DNA在260/280吸光度值，1.6～2.0為合格DNA待測樣本，保存于-80℃冰箱待測。

1.2.2基因分型 PCR擴增引物：上游：5′-CTAACTGATTGTTGAACTTGGGC-3′，下游：5′-TGCAAGGTGGGTACAGGATAAACT-3′，PCR反應(yīng)體系：1.5 μl 基因組DNA、5 μl PCR Master Mix、1.5 μl的40×TaqMan SNPs Genotyping Assay Mix、2 μl的ddH2O。PCR擴增條件：95℃激活A(yù)mpli Taq酶10 min，95℃變性15 s，60℃延伸1 min，共 40個循環(huán)。擴增后采用TaqMan-MGB等位基因分型試劑盒對DNA樣本進行分型，根據(jù)各自VIC、FAM熒光強度對不同等位基因進行區(qū)分。

1.2.3WNK1檢測 免疫印跡法測定骨髓組織WNK1。取ALL患兒骨髓組織并用磷酸鹽緩沖溶液沖洗細胞，以RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)裂解、150 000 g離心10 min后收集上清液，保存于-20℃冰箱待測。在聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉脫脂后，以兔抗人WNK1單克隆抗體1∶1 000于4℃孵育24 h，然后以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗1∶5 000室溫孵育2 h，以β-action為對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用擬合優(yōu)度皮爾森卡方檢驗對ALL組、對照組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡進行檢測；計數(shù)資料采用χ2檢驗；非條件Logistic回歸模型分析基因多態(tài)性與ALL易感性、基因多態(tài)性與環(huán)境因素交互作用，以比值比(odds ratios，OR)及95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)進行描述；采用Kaplan-Meier法分析患兒5年無復(fù)發(fā)生存(relapse free survival，RFS)、5年無事件生存(event free survival，EFS)及5年總生存(overall survival，OS)情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡分析 納入研究的86例ALL患兒中，GG型45例(52.3%)，GT型32例(37.2%)，TT型9例(10.5%)，納入研究的95例對照兒童中，GG型31例(32.6%)，GT型47例(49.5%)， TT型17例(17.9%)， 兩組兒童基因分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律(P>0.05)，表明數(shù)據(jù)來自同一蒙德爾群體。

2.2ALL易感性分析 GG型、GT型、TT型在ALL組與對照組兒童中存在顯著差異(P=0.024)，較之于對照組，等位基因相對風險分析顯示，GG型基因會增加ALL患病風險。合并分析顯示，ALL患兒G等位基因占比顯著高于對照組(P=0.007)，合并后分析顯示G等位基因較之T等位基因會顯著增加ALL患病。見表1。

表1 基因分布及ALL易感性分析

2.3ALL患兒化療緩解及生存分析 GG型患兒第1療程誘導(dǎo)治療完全緩解率為91.1%(41/45)，GT/TT型患兒為90.2%(37/41)，二者無顯著差異(χ2=0.019，P=0.890)。Kaplan-Meier生存分析顯示，GG型患兒5年RFS為71.5%，顯著低于GT/TT型患兒的86.1%(P=0.031)；GG型患兒5年EFS為67.3%，顯著低于GT/TT型患兒的81.8%(P=0.027)；在5年OS比較中，GG型患兒為78.6%，顯著低于GT/TT型患兒的92.5%(P=0.012)。見圖1。

圖1 ALL患兒5年生存情況分析Fig.1 Analysis of five-year survival for children with ALLNote:A.Comparison of relapse-free survival rates of children with different genotypes; B.Comparison of event-free survival rates of children with different genotypes; C.Comparison of total survival rates of children with different genotypes.

2.4基因多態(tài)性與環(huán)境因素交互作用 非條件Logistic多元回歸模型分析WNK1基因rs11611246位點基因多態(tài)性與環(huán)境因素有無交互作用，結(jié)果顯示GG基因型與“出生后居室裝修”、“放射性物質(zhì)接觸”具有協(xié)同交互作用，攜帶GG基因型兒童在出生后居室裝修(OR：3.085，95%CI：1.963～3.597，P=0.016)、放射性物質(zhì)接觸(OR：3.571，95%CI：2.628～4.277，P=0.008)會顯著增加ALL發(fā)病風險，與“化學(xué)性物質(zhì)接觸”、“住房500 m內(nèi)工廠”無顯著交互作用(P>0.05)。見表2。

表2 基因多態(tài)性與環(huán)境因素交互作用

2.5ALL患兒WNK1表達 對不同基因型ALL患兒WNK1蛋白表達檢測，以相對于β-action灰度值表達WNK1表達量，結(jié)果顯示GG型ALL患兒WNK1在骨髓表達顯著低于GT型、TT型患兒(P<0.05)，而GT型、TT型患兒間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 ALL患兒WNK1蛋白表達圖(免疫印跡)及相對灰度值Fig.2 WNK1 protein expression map (immunoblot) and relative gray value in ALL children

3 討論

WNK1基因位于12號染色體12p13.3位置，由28個外顯子及多個轉(zhuǎn)錄起始位點構(gòu)成，其指導(dǎo)合成的WNK1包含2 382個氨基酸，是病理生理應(yīng)答過程中重要因子。WNK1可以上調(diào)或下調(diào)鉀耦合氯轉(zhuǎn)運蛋白參與鉀、鈉離子在細胞內(nèi)外轉(zhuǎn)移，同時還可激活上皮細胞鈉通道蛋白調(diào)控內(nèi)環(huán)境電解質(zhì)平衡[7]。WNK1內(nèi)含子突變后的過表達可抑制WNK家族另一成員WNK4，繼而影響Na-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白SLC12A3調(diào)節(jié)功能，這是發(fā)生假性2C型高血壓(PHA2C)的主要原因之一[8]。此外，WNK1還可能參與卵巢癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤發(fā)病[9]。WNK1基因部分片段與剪接的RAD52基因反義，這使得RAD52轉(zhuǎn)錄能力會受到WNK1基因影響，導(dǎo)致染色體乳腺癌和卵巢癌等位基因危險突變位點12p12.2-p13位點DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力下降引起相關(guān)腫瘤發(fā)生與進展[10]。ALL發(fā)病機制復(fù)雜，遺傳因子的改變成為該病不可忽略的診斷、治療因素，Hui等[11]研究認為基因突變后干擾下游信號傳遞是ALL發(fā)病主要路徑之一。PI3K/AKT/mTOR信號通路異?；罨贏LL及部分急性髓性白血病中常見，WNK1作為絲氨酸/蘇氨酸激酶可以使MAPK磷酸化，磷酸化的MAPK能夠激活PI3K/AKT/mTOR信號通路[12，13]。故本研究選擇WNK1基因rs11611246為研究對象，分析其基因位點多態(tài)性與ALL關(guān)聯(lián)性，目前尚未見相關(guān)報道。

研究結(jié)果顯示，rs11611246位點GG型、GT型、TT型在ALL患兒、健康兒童中呈顯著差異表達，GG型比例在ALL患兒中顯著升高，其OR達到2.002，進一步合并分析顯示G等位基因OR為2.189，提示G等位基因可能是ALL易感基因。除了表觀遺傳學(xué)因素外，環(huán)境因素可能是ALL發(fā)病另一重要原因，這得到眾多流行病學(xué)研究證實[14，15]。但越來越多的學(xué)者認為在環(huán)境、遺傳因素同時存在的情況下，二者之間是否存在交互作用可能是ALL發(fā)病與否的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機制[16]。本研究分析了rs11611246位點多態(tài)性與環(huán)境因素交互作用，結(jié)果顯示GG基因型與出生后居室裝修、放射性物質(zhì)接觸存在協(xié)同交互作用。居室裝修材料可能會含有甲醛、苯及易揮發(fā)有機物，而這些有害物質(zhì)具有強致病性，部分物質(zhì)還具有致癌性，其中油漆含有的甲苯是已知基因毒物質(zhì)，這可能是“居室裝修”與基因多態(tài)性存在協(xié)同交互作用的主要原因。“放射性”物質(zhì)可致DNA堿基排列改變、堿基缺失及異常修復(fù)能力減弱，是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的主要環(huán)境因素之一。本研究提示這兩種環(huán)境均可與rs11611246位點GG基因發(fā)生協(xié)同交互作用，在日常生活中應(yīng)盡量避免。

基因多態(tài)性分析在惡性腫瘤診治中的重要作用之一即判斷預(yù)后。白血病復(fù)發(fā)是總體環(huán)境下多重因素作用的結(jié)果，包括白血病宿主免疫能力、化療藥物敏感性及反應(yīng)性、骨髓微環(huán)境對白血病細胞抑制或支持作用等，基因突變可能通過復(fù)雜通路下調(diào)腫瘤抑制因子、凋亡調(diào)節(jié)因子等參與白血病復(fù)發(fā)而受到眾多學(xué)者關(guān)注[17]。本研究結(jié)果顯示rs11611246位點不同基因型ALL患兒第1療程誘導(dǎo)治療完全緩解率無明顯差異，表明該位點基因型可能對ALL早期治療并無明顯影響。進一步Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，GG型患兒5年RFS、EFS及OS等預(yù)后指標均顯著低于GT/TT型患兒。WNK1具有抑制細胞增殖的能力，Ding等[18]通過轉(zhuǎn)染不同基因型WNK1發(fā)現(xiàn)，突變型較之于野生型WNK1基因指導(dǎo)合成WNK1蛋白能力下降，導(dǎo)致突變型WNK1宿主細胞增殖能力顯著增強，這可能是WNKI影響惡性腫瘤預(yù)后機制之一。本研究結(jié)果顯示，GG型患兒WNK1蛋白在骨髓表達顯著下降，與GG型患兒生存預(yù)后情況相符，提示rs11611246位點多態(tài)性可能通過干擾WNKI表達來影響ALL預(yù)后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)WNK1基因rs11611246位點多態(tài)性與ALL患病風險存在一定相關(guān)性，并且與“出生后居室裝修”、“放射性物質(zhì)接觸”有協(xié)同交互作用，雖然對患兒短期治療效果無明顯影響，但是GG型患兒5年生存指標更差。由于基因內(nèi)部單核苷酸多態(tài)性可以影響基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯及蛋白修飾等蛋白表達流程，本課題組后續(xù)還需從基礎(chǔ)研究進一步闡釋W(xué)NK1基因?qū)LL的影響機制。