白術(shù)多糖對小鼠淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用①

徐 偉 方思佳 關(guān) 然 張岑容 胡松華

(浙江大學動物科學學院，杭州 310058)

中藥白術(shù)系菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有燥濕利水、補脾健胃、止汗、安胎等功效，主治脾虛泄瀉、食少肚脹、倦怠乏力、胎動不安等病癥。白術(shù)為常用大宗中藥材，據(jù)統(tǒng)計，2010年版《中國藥典》共收載113種含白術(shù)的中藥制劑，年需求量約為13 000噸。研究表明，白術(shù)的主要化學成分為揮發(fā)油、內(nèi)酯及多糖，白術(shù)多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-6]。作為天然大分子物質(zhì)，多糖對機體免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，多糖類免疫調(diào)節(jié)劑已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和保健食品行業(yè)[7]。作者所在實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳房淋巴結(jié)部位注射白術(shù)多糖能降低其體細胞數(shù)量，緩解其乳腺感染癥狀，并初步證明其機制可能是其白術(shù)多糖對淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用[8-11]。本研究通過分析白術(shù)多糖聯(lián)合ConA或LPS對體外培養(yǎng)小鼠脾淋巴細胞增殖、細胞因子分泌、轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達和淋巴細胞亞群等的影響，探討白術(shù)多糖調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫應(yīng)答的可能作用機制，為從細胞和分子層面理解白術(shù)多糖通過增強乳腺免疫功能治療奶牛乳房炎提供理論依據(jù)，對白術(shù)多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)與應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 白術(shù)多糖由浙江大學中獸醫(yī)研究室制備，苯酚硫酸法檢測其總糖含量為95.66%，并經(jīng)鱟試劑檢測確認不含內(nèi)毒素[9]；改良型RPMI1640培養(yǎng)基(SH30809.01)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，SV30087)購自美國Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，M2128)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，L2630)、刀豆蛋白A(Concanavallin A，ConA，L7647)購自美國Sigma公司；紅細胞裂解液(R1010)、Hank′s平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS，H1045)購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠細胞因子IL-2(70-EK202)、IL-6(70-EK206)、IL-10(70-EK210)、TNF-α (70-EK282)ELISA試劑盒和IgG(70-EK271)ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；青霉素-鏈霉素溶液(C0222)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC anti-mouse CD4(561828)、PE anti-Mouse CD8(561095)、APC anti-mouse CD3(561826)和PE anti-mouse CD19(561736)流式抗體購自美國BD公司；RNA提取試劑盒(RN28)購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，RR036A)和熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2實驗動物 6～8周齡雌性ICR小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自上海史萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于IVC獨立送風飼養(yǎng)籠具，飼喂無菌飼料和飲水，(25±1)℃、(50±10)%濕度預飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.3儀器與設(shè)備 SW-CJ-2F型超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；Multiskan FC型酶標儀購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；5810R型臺式大容量高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；VORTEX-5型渦旋混合器、QB-9002型微孔板快速振蕩器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；T100TMThermal Cycler和CFX96 Touch PCR儀購自美國 Bio-Rad 公司；FACSVerse型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1小鼠脾淋巴細胞懸液制備 脫頸處死小鼠，75%乙醇中浸泡5 min，無菌分離脾臟，加HBSS研磨后200目濾網(wǎng)過濾。收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入3 ml紅細胞裂解液，于冰上靜置3 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞用PBS洗2遍后重懸于1640完全培養(yǎng)基(10% FBS+1%雙抗)，臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)>95%時，調(diào)整細胞濃度至5×106個/ml。

1.2.2脾淋巴細胞增殖試驗 取1.2.1脾淋巴細胞懸液100 μl/孔加入96孔板，試驗組每孔加入50 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和50 μl不同濃度的白術(shù)多糖溶液(終濃度為12.5、25、50、100和200 μg/ml)，對照組每孔加入100 μl ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每組3個復孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)44 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 500 r/min離心8 min，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min充分溶解結(jié)晶，酶標儀檢測OD570值。

1.2.3細胞因子含量檢測 細胞鋪板同1.2.2，白術(shù)多糖終濃度為25、50和100 μg/ml。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心5 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測樣品中IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.2.4IgG含量檢測 細胞鋪板同1.2.2，僅設(shè)LPS+白術(shù)多糖(終濃度為25、50和100 μg/ml)和LPS對照組，每組3個復孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心5 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測樣品IgG含量。

1.2.5轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達檢測 于24孔板中每孔加入1 ml細胞懸液，試驗組每孔加入500 μl ConA(10 μg/ml)或LPS(10 μg/ml)和500 μl不同濃度的白術(shù)多糖溶液(終濃度為25、50和100 μg/ml)，對照組每孔加入1 ml ConA(5 μg/ml)或LPS(5 μg/ml)，每組3個復孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件：采用20 μl體系，其中10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，2 μl cDNA，6.4 μl RNase-free H2O，95℃(30 s)，95℃(5 s)，60℃(31 s)，40 個循環(huán)，2-ΔΔCt法計算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及擴增長度見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.2.6淋巴細胞亞群檢測 于24孔板中每孔加入1 ml細胞懸液，試驗組每孔加入500 μl LPS(10 μg/ml)和500 μl白術(shù)多糖溶液(400 μg/ml)，對照組每孔加入1 ml LPS(5 μg/ml)。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，收集細胞，分別用APC-CD3和PE-CD19或FITC-CD4和PE-CD8于4℃染色30 min，設(shè)置相應(yīng)對照，PBS洗滌2次后流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1白術(shù)多糖聯(lián)合ConA或LPS對脾淋巴細胞增殖的影響 不同濃度白術(shù)多糖聯(lián)合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，其OD值均顯著高于ConA對照組(P<0.01)，且在12.5～100 μg/ml呈劑量依賴性，表明白術(shù)多糖能夠促進ConA誘導的小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖，見圖1A。不同濃度的白術(shù)多糖聯(lián)合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，其OD值均顯著低于LPS對照組(P<0.05)，表明白術(shù)多糖對LPS刺激的小鼠脾臟B淋巴細胞增殖具有抑制作用，見圖1B。

圖1 白術(shù)多糖聯(lián)合ConA或LPS對脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on splenic lymphocyte proliferationNote:Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2白術(shù)多糖聯(lián)合ConA對脾淋巴細胞細胞因子水平的影響 不同濃度的白術(shù)多糖聯(lián)合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10水平均顯著高于ConA對照組(P<0.01)，表明白術(shù)多糖能夠促進ConA誘導的細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10分泌，見圖2。

圖2 白術(shù)多糖聯(lián)合ConA對細胞因子水平的影響Fig.2 Effects of RAMPtp combined with ConA on cytokine levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.3白術(shù)多糖聯(lián)合LPS對脾淋巴細胞細胞因子和IgG的影響 不同濃度的白術(shù)多糖聯(lián)合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，細胞因子TNF-α和IgG均顯著低于LPS對照組(P<0.01),且均呈劑量依賴性，表明白術(shù)多糖抑制LPS刺激的脾淋巴細胞分泌TNF-α和IgG，見圖3。

圖3 白術(shù)多糖聯(lián)合LPS對TNF-α和IgG水平的影響Fig.3 Effects of RAMPtp combined with LPS on TNF-α and IgG levelsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups，**.P<0.01.

2.4白術(shù)多糖聯(lián)合ConA或LPS對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響 不同濃度的白術(shù)多糖聯(lián)合ConA作用于小鼠脾淋巴細胞時，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata3 mRNA表達呈劑量依賴性上調(diào)(P<0.01)，表明白術(shù)多糖能夠提高ConA誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata3 mRNA的表達水平，見圖4A；不同濃度的白術(shù)多糖聯(lián)合LPS作用于小鼠脾淋巴細胞時，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的mRNA表達呈劑量依賴性下調(diào)(P<0.01)，表明白術(shù)多糖可抑制LPS誘導的NF-κB p65的mRNA表達，見圖4B。

圖4 白術(shù)多糖聯(lián)合ConA或LPS對轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響Fig.4 Effects of RAMPtp combined with ConA or LPS on mRNA expressions of transcription factorsNote: Compared with control,##.P<0.01;compared with ConA or LPS groups,**.P<0.01.

2.5白術(shù)多糖聯(lián)合LPS對脾淋巴細胞亞群的影響 LPS處理后可降低CD3、CD4和CD8淋巴細胞亞群的比例，提高CD19細胞亞群的比例，與單獨使用LPS相比，當與白術(shù)多糖聯(lián)合使用時，CD3、CD4和CD8亞群的比例均有所提高，CD19亞群比例略微降低，表明白術(shù)多糖對T淋巴細胞具有免疫刺激作用，可調(diào)節(jié)其亞群比例的變化。見圖5。

圖5 白術(shù)多糖對LPS刺激的淋巴細胞亞群的影響Fig.5 Effects of RAMPtp on LPS-stimulated lympho-cyte subpopulation

3 討論

作為廣譜生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，多糖具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種功能[12]。天然活性多糖在調(diào)節(jié)機體免疫功能的同時無明顯副作用，是理想的免疫調(diào)節(jié)劑。作為機體體液免疫和細胞免疫的中心，脾臟是T、B淋巴細胞定居的主要場所，因此脾淋巴細胞是研究機體免疫功能的常用細胞[13]。T、B淋巴細胞是參與機體免疫應(yīng)答的主要免疫效應(yīng)細胞，二者的體外增殖轉(zhuǎn)化能力是機體細胞免疫功能的重要體現(xiàn)。淋巴細胞增殖的評價依賴于選擇的絲裂原類型，ConA主要刺激T淋巴細胞增殖，LPS則主要誘導B淋巴細胞增殖[14]。不同來源的多糖對T、B淋巴細胞可能表現(xiàn)出不同的免疫刺激作用，如鐵皮石斛多糖和烏頭多糖在體外能夠同時促進ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖，表明其對T、B淋巴細胞均有促進作用，而云芝多糖CVP則選擇性作用于B淋巴細胞，對T淋巴細胞無免疫刺激作用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能夠促進ConA誘導的T淋巴細胞增殖，但抑制LPS誘導的B淋巴細胞增殖，這表明白術(shù)多糖可能對脾淋巴細胞培養(yǎng)體系中的T、B淋巴細胞具有選擇性作用。

淋巴細胞介導的免疫反應(yīng)與其分泌的細胞因子密切相關(guān)，Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，介導細胞免疫應(yīng)答；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等細胞因子，介導體液免疫應(yīng)答[18]。研究表明，杜仲多糖和荔枝多糖均能協(xié)同ConA促進Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子IL-4的分泌[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖和ConA聯(lián)合作用于脾淋巴細胞，細胞因子IL-2、TNF-α、IL-6和IL-10的分泌均顯著提高，表明白術(shù)多糖能活化T淋巴細胞并同時增強Th1和Th2型免疫反應(yīng)，該結(jié)果在Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet(Th1型)和Gata3(Th2型)mRNA表達水平上得到進一步證實。免疫球蛋白的生成是B淋巴細胞活化的重要標志之一，研究表明黃芪多糖APS和云芝多糖CVP均能促進小鼠B淋巴細胞分泌免疫球蛋白[17,21]。本研究對白術(shù)多糖聯(lián)合LPS作用脾淋巴細胞后的TNF-α和IgG水平進行檢測，其含量均顯著降低，表明白術(shù)多糖能抑制LPS誘導的脾淋巴細胞培養(yǎng)體系中B淋巴細胞的活化，并進一步證明其機制可能是由于對NF-κB通路的抑制作用。CD4和CD8是T淋巴細胞的重要亞群，本研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖可一定程度減弱LPS誘導的CD3、CD4和CD8亞群比例的降低，表明白術(shù)多糖對T淋巴細胞具有活化作用，可調(diào)節(jié)其亞群比例變化。

綜上所述，白術(shù)多糖能促進ConA誘導的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化，但對LPS刺激的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化具有抑制作用，但其作用機制需進一步研究。