基于miR-155/SOCS1軸研究復方甘草酸苷治療特應性皮炎小鼠的作用機制①

常 晶 姚戰(zhàn)非 張 鐸 王 琳

(內蒙古民族大學附屬醫(yī)院皮膚科，通遼 028000)

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是以劇烈瘙癢、濕疹樣皮損為主要特征的慢性復發(fā)性皮膚炎癥，可引發(fā)口唇炎、全身皮膚干燥、手足炎等并發(fā)癥[1]。近年來，AD全球發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響患者生活質量及身心健康[2]。目前治療AD的常用藥物為糖皮質激素，但長期使用不良反應較大[3]。復方甘草酸苷具有類皮質醇化學結構及活性，可作為激素替代藥物發(fā)揮抗過敏、抗炎作用，用于AD治療，但作用機制尚未明確[4-6]。miR-155是一種不編碼蛋白的小分子RNA，可調節(jié)炎癥反應，參與AD發(fā)生發(fā)展，在AD小鼠皮損部位及血清中表達顯著高于正常小鼠[7,8]。SOCS1是一種對炎癥因子通路有負向調節(jié)作用的蛋白，調節(jié)AD、銀屑病等皮膚炎癥性疾病，是治療AD的靶點[9]。miR-155可抑制SOCS1表達，促進炎癥發(fā)展，但目前復方甘草酸苷治療AD的作用機制是否與miR-155、SOCS1有關尚未明確[10]。本文通過建立AD小鼠模型研究復方甘草酸苷治療AD的作用抑制，為AD藥物研發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級BALB/c小鼠購自廣東雙林生物制藥有限公司，雌雄各半，體質量20～25 g，許可證號：SCXK(粵)2018-0003。飼養(yǎng)于清潔、安靜、通風良好環(huán)境，自然光照，自由飲水、攝食，22℃、相對濕度50%，定時更換墊料，清理、消毒鼠籠，暫養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2主要試劑 MC903購自北京綠源伯德生物科技有限公司(貨號：R019162)；復方甘草酸苷購自哈藥集團三精制藥股份有限公司(25 mg/粒)；miR-155 agomir、miR-155 agomir陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；miR-155、U6、SOCS1、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；HE染色試劑盒購自上海生工公司(貨號：E607218-0200)；小鼠IgE、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒、兔源GAPDH一抗、兔源SOCS1一抗、羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司(貨號分別為：ab157718、ab208348、ab100712、ab181602、ab62584、ab6721)；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司(貨號分別為：9108、RR037Q/A/B、639519)；蛋白裂解液、BCA試劑盒均購自上海碧云天公司(貨號分別為：P0013K、P0011)等。

1.1.3主要儀器 石蠟切片機購自德國Leica公司；RM2235實驗室教學生物顯微鏡購自日本尼康公司；3900高通量DNA合成儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司；熒光定量PCR儀、酶標儀、蛋白電泳儀、半干轉膜儀均購自美國Bio-Rad公司；2500凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司等。

1.2方法

1.2.1建模及分組給藥 參照文獻[11]：MC903溶于無水乙醇配制為2 nmol/L 的溶液，每天均勻涂布于小鼠兩耳背部，各20 μl，持續(xù)10 d，當小鼠耳部皮膚出現紅斑出血、結痂鱗屑、水腫、抓痕、糜爛時，提示造模成功。隨機分為模型組、miR-155 agomir組、miR-155 agomir陰性對照組、復方甘草酸苷組、復方甘草酸苷+miR-155 agomir組，每組12只，另取12只小鼠兩耳耳背涂布等體積無水乙醇作為對照組。復方甘草酸苷、miR-155 agomir、miR-155 agomir陰性對照均用生理鹽水溶解，分別配制為9.1 mg/ml、20 μmol/L、20 μmol/L溶液備用。參照文獻[12]進行劑量換算，復方甘草酸苷組小鼠灌胃給予復方甘草酸苷；參照說明書及文獻[13]，miR-155 agomir組、miR-155 agomir陰性對照組小鼠尾靜脈注射miR-155 agomir、miR-155 agomir陰性對照5 ml/(kg·d)；復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠在復方甘草酸苷組基礎上尾靜脈注射給予5 ml/(kg·d) miR-155 agomir；對照組和模型組小鼠每天灌胃、尾靜脈注射等體積生理鹽水，持續(xù)14 d。

1.2.2小鼠耳部皮損臨床癥狀觀測 末次給藥24 h后，觀察各組小鼠耳部皮損情況，根據紅斑/出血、水腫/糜爛、剝脫/干燥3個癥狀的嚴重程度進行皮炎評分，最終得分為3個癥狀得分之和，最高為9分，評分標準如表1[14]。

1.2.3小鼠耳部組織病理學標本采集 末次給藥24 h后，斷頭處死小鼠，腹主動脈取血約2 ml，3 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清(血清)儲存于-80℃?zhèn)溆?。剪下小鼠耳部組織，一側儲存于-80℃?zhèn)溆?，另一側?%多聚甲醛固定、梯度酒精(由低至高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切片機切片，脫蠟、梯度酒精浸泡(由高到低)，置于蒸餾水中，HE染色，漂洗、脫水、透明、封片后光學顯微鏡下觀察小鼠耳部組織病理學情況。

表1 Holfbauer病理評分標準[14]

1.2.4ELISA檢測血清IgE、TNF-α，IL-6水平1.2.3中血清4℃解凍后，分別使用ELISA試劑盒測定血清IgE、TNF-α、IL-6水平，按照說明書操作。

1.2.5qRT-PCR檢測耳部組織miR-155、SOCS1 mRNA水平 取1.2.3中凍存的耳部組織約0.5 g剪碎，參照RNAiso Plus說明書采用RNAiso Plus提取總RNA，逆轉錄為cDNA、熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR反應，miR-155以U6為內參，SOCS1以GADPH為內參，2-ΔΔCt法計算，引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.6Western blot檢測耳部組織miR-155、SOCS1蛋白表達 取1.2.3中凍存的耳部組織約0.5 g剪碎，加入蛋白裂解液(已加蛋白酶抑制劑)，冰浴勻漿、離心后BCA試劑盒測定蛋白總濃度，煮沸變性，各組取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉移至蛋白硝酸纖維膜，根據蛋白分子量截取目的蛋白條帶，置于5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，SOCS1一抗4℃孵育過夜，羊抗兔二抗室溫孵育 2 h，TBST漂洗，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶并以Tanon軟件分析蛋白相對表達量。

2 結果

2.1各組小鼠耳部形態(tài)變化 對照組小鼠耳部無皮炎癥狀，皮炎評分為0分；模型組小鼠雙側耳背出現皮膚增厚、明顯紅斑、充血水腫、干燥鱗屑等皮炎癥狀，皮炎評分顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-155 agomir組小鼠皮炎癥狀加重，皮炎評分升高(P<0.05)；復方甘草酸苷組小鼠皮炎癥狀減輕，皮炎評分降低(P<0.05)。與miR-155 agomir組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠皮炎癥狀減輕，皮炎評分降低(P<0.05)。與復方甘草酸苷組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠皮炎癥狀加重，皮炎評分升高(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 小鼠耳部皮炎癥狀Fig.1 Dermatitis in mouse earsNote:A.Control group；B.Model group；C.miR-155 agomir group；D.miR-155 agomir negative control group；E.Compound glycyrrhizin group；F.Compound glycyrrhizin +miR-155 agomir group.

表3 各組小鼠耳部皮炎評分

2.2各組小鼠耳組織病理癥狀 對照組小鼠耳組織結構清晰、正常，無明顯病理癥狀，模型組小鼠耳組織可見表皮層顯著增生、棘細胞層變厚、毛細血管擴張、組織水腫充血、大量炎癥細胞浸潤等病理癥狀。與模型組相比，miR-155 agomir組小鼠上述病理癥狀加重；復方甘草酸苷組小鼠上述病理癥狀減輕。與miR-155 agomir組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠上述病理癥狀減輕。與復方甘草酸苷組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠上述病理癥狀加重，見圖2。

圖2 各組小鼠耳組織病理癥狀比較(×200)Fig.2 Comparison of pathological symptoms of ear tissues of mice in each group(×200)Note:A.Control group；B.Model group；C.miR-155 agomir group；D.miR-155 agomir negative control group；E.Compound glycyrrhizin group；F.Compound glycyrrhizin +miR-155 agomir group.

2.3各組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平 與對照組相比，模型組小鼠血清中IgE、TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)。與模型組相比，miR-155 agomir組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；復方甘草酸苷組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)。與miR-155 agomir組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)。與復方甘草酸苷組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠血清IgE、TNF-α、IL-6水平

2.4各組小鼠耳組織miR-155、SOCS1 mRNA水平比較 與對照組相比，模型組小鼠耳組織miR-155水平升高(P<0.05)，SOCS1 mRNA水平降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-155 agomir組小鼠耳組織miR-155水平升高(P<0.05)，SOCS1 mRNA水平降低(P<0.05)；復方甘草酸苷組小鼠耳組織miR-155水平降低(P<0.05)，SOCS1 mRNA水平升高(P<0.05)。與miR-155 agomir組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠耳組織miR-155水平降低(P<0.05)，SOCS1 mRNA水平升高(P<0.05)。與復方甘草酸苷組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠耳組織miR-155水平升高(P<0.05)，SOCS1 mRNA水平降低(P<0.05)，見表5。

表5 各組小鼠耳組織miR-155、SOCS1 mRNA相對表達

2.5各組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達水平 與對照組相比，模型組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-155 agomir組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達降低(P<0.05)；miR-155agomir陰性對照組小鼠表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；復方甘草酸苷組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達升高(P<0.05)。與miR-155 agomir組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達升高(P<0.05)。與復方甘草酸苷組相比，復方甘草酸苷+miR-155 agomir組小鼠耳組織SOCS1蛋白表達降低(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 Western blot檢測各組小鼠耳組織中SOCS1蛋白表達水平Fig.3 Western blot was used to detect expression of SOCS1 protein in ear tissues of mice in each groupNote:A.Control group；B.Model group；C.miR-155 agomir group；D.miR-155 agomir negative control group；E.Compound glycyrrhizin group；F.Compound glycyrrhizin +miR-155 agomir group.

表6 各組小鼠耳組織SOCS1蛋白相對表達

3 討論

AD是慢性、復發(fā)性、濕疹性皮膚炎癥，治愈率較低，兒童發(fā)病率較高，患兒生長發(fā)育和身心健康。AD發(fā)病機制復雜，與遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素有關，是活化的Th2型淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞相互作用引起的以炎癥細胞浸潤為主的皮膚炎癥反應[15]。既往研究表明，MC903作為人工合成的維生素D3類似物，可促進小鼠T細胞活化，介導炎癥，導致AD[16]。IgE是一種分泌型免疫球蛋白，可引起Ⅰ型超敏反應，TNF-α、IL-6為炎癥反應的調節(jié)因子，AD患者血清IgE、TNF-α及IL-6水平明顯升高，其表達水平與AD嚴重程度呈正相關[17]。本研究使用MC903涂布小鼠耳背部建立AD模型，結果顯示模型組小鼠雙側耳背出現皮膚增厚、紅斑、充血水腫、干燥鱗屑等皮炎癥狀，耳組織出現表皮層顯著增生、棘細胞層變厚、毛細血管擴張、組織水腫充血、大量炎癥細胞浸潤等病理癥狀，耳部皮炎評分、血清IgE及TNF-α、IL-6水平、可組織miR-155水平顯著升高，表明模型組小鼠血清中炎癥相關因子明顯升高，耳部發(fā)生嚴重炎癥，出現AD典型癥狀，建模成功。

復方甘草酸苷可通過降低磷酯酶A2活性抑制炎癥介質合成分泌，減輕炎癥反應，可作為激素的替代藥物，用于AD治療，療效較好，且更為安全，廣泛應用于臨床，但其作用機制尚不明確[18，19]。研究表明，miR-155/SOCS1可介導炎癥反應，下調miR-155表達可促進SOCS1表達，抑制Ox-LDL誘導炎癥反應[20]。AD患者血清中，miR-155表達顯著升高，SOCS1 mRNA表達顯著降低，且miR-155表達與AD嚴重程度呈正相關，與SOCS1 mRNA表達呈負相關，推測miR-155/SOCS1信號可能是復方甘草酸苷治療AD的作用靶點[21]。本研究結果顯示，復方甘草酸苷灌胃治療后，小鼠AD癥狀減輕，且耳組織miR-155水平顯著降低，SOCS1 mRNA及蛋白水平升高，尾靜脈注射miR-155 agomir可上調miR-155表達，加重小鼠AD癥狀，SOCS1 mRNA及蛋白水平進一步降低，表明復方甘草酸苷可調控miR-155/SOCS1信號，且可能是治療AD的作用機制。聯合應用復方甘草酸苷及miR-155 agomir，小鼠耳部炎癥、病理癥狀比單獨使用miR-155 agomir減輕，比復方甘草酸苷組加重；血清IgE及TNF-α、IL-6水平、耳組織miR-155水平低于miR-155 agomir組，高于復方甘草酸苷組；耳組織SOCS1 mRNA及蛋白表達高于miR-155 agomir組，低于復方甘草酸苷組，表明上調miR-155表達可抑制復方甘草酸苷減輕炎癥反應的作用，拮抗其對AD小鼠的治療作用，提示調控miR-155/SOCS1軸是復方甘草酸苷治療AD的作用機制之一。

綜上所述，miR-155在AD小鼠中高表達，SOCS1在SD小鼠中低表達，復方甘草酸苷可通過抑制miR-155表達，促進SOCS1表達減輕AD小鼠炎癥反應，改善臨床癥狀。復方甘草酸苷治療AD的作用機制之一可能是通過調控miR-155/SOCS1軸實現的。本文初步探討了復方甘草酸苷治療AD的作用機制，但具體調控步驟尚需進一步研究。