28色流式對中軸型脊柱關節(jié)炎患者外周血中T細胞亞群差異的鑒定①

李 捷 趙志斌 王崧榕 卞振華 廉哲雄

(南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣州 510000)

中軸型脊柱關節(jié)炎(axial spondyloarthritis，ax-SpA)是以骶髂關節(jié)和脊柱附著點炎癥為主要癥狀，四肢大關節(jié)，椎間盤纖維環(huán)及其附近結(jié)締組織纖維化和骨化，以及關節(jié)強直為病變特點的慢性自身免疫性疾病。某些微生物(如克雷伯桿菌)與易感者自身組織有共同抗原，可引起一系列異常免疫應答[1]。明確引起異常免疫應答的疾病特異性免疫細胞，及時給予早期干預，對抑制ax-SpA的發(fā)展有積極作用。多通道流式技術(shù)結(jié)合大數(shù)據(jù)分析法為發(fā)現(xiàn)新的致病性細胞小亞群提供了可能。本文通過高通量流式細胞術(shù)檢測我院5例ax-SpA患者外周血樣本，并對其出現(xiàn)的特異性T細胞小亞群進行分析。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床樣本信息 5例符合國際脊柱關節(jié)炎評估協(xié)會(ASAS)評估標準的ax-SpA患者和5例健康志愿者來自南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院風濕免疫科，參與者知情同意，每人抽取外周血2 ml用于后續(xù)實驗。5例ax-SpA患者平均年齡(32.8±10.89)歲，男女比例為2∶3，血C-反應蛋白(CRP)平均水平為(3.47±1.19)mg/L,紅細胞沉降率(ESR)為(31.00±17.46)mm/h，Bath AS疾病活動指數(shù)(BASDAI)、Bath AS測量指數(shù)(BASMI)、Bath AS功能指數(shù)(BASFI)分別為2.20±1.98、2.16±1.68、2.64±2.79;5例健康志愿者包括3例男性和2例女性，平均年齡(25.6±1.14)歲。

1.1.2主要試劑與儀器 28色流式抗體(表1)、BD FACSymphony流式細胞儀購自BD公司；Ficoll溶液購自STEMCELL Technologies公司。

1.2方法

1.2.1外周血PBMC細胞的分離 臨床患者及健康對照者外周靜脈穿刺取血2 ml保存于乙二胺四乙酸-K3(EDTA-K3)真空采血管，在管內(nèi)加入緩沖液(PBS+1%BSA)稀釋至4 ml，混勻。將4 ml Ficoll溶液加到15 ml離心管底部，血液稀釋液緩慢加入Ficoll上層，密度梯度離心(500 g×20 min，升6降2)，離心后吸管收集中間白膜層細胞，加入新的15 ml 離心管中，450 g離心5 min收集細胞。

1.2.2FACS檢測細胞表面標志 收集細胞用1 ml PBS緩沖液(含1%BSA)重懸，混勻，吸取10 μl 細胞懸液，按照1∶1 的比例與臺盼藍混勻后顯微鏡下計數(shù)。收集細胞(1×106個/管)，用30 μl小鼠血清稀釋液(含10 μl小鼠血清和10 μl PBS緩沖液)重懸細胞封閉，4℃封閉15 min。加入30 μl含有特異性表面標記熒光抗體混合液，4℃避光標記20 min。 加滿PBS緩沖液(含1%BSA)混勻，3 000 g離心2 min，收集細胞，并用300 μl PBS緩沖液(含1%BSA)重懸，上機檢測。

1.2.3FlowJo結(jié)合R語言數(shù)據(jù)分析 首先使用FlowJo把需要進行降維分析的數(shù)據(jù)導出為帶有校正通道的CSV表格，利用R腳本讀取數(shù)據(jù)形成帶有樣品標識的混合矩陣，并進行降維前的數(shù)據(jù)預處理，包括去除空通道以及FSC、SSC等通道，對混合矩陣進行標準化和均一化處理。完成數(shù)據(jù)預處理后，利用seurat包進行后續(xù)分析，首先寫入樣品信息，可選擇利用Harmony包以分組或批次為單位校正數(shù)據(jù)，利用FindVariableFeature函數(shù)尋找細胞間差異，再次對混合矩陣數(shù)據(jù)均一化處理后進行主成分(PCA)分析，選擇主成分數(shù)量進行細胞間空間距離的計算以及聚類，最后進行TSNE以及UMAP降維。

FlowJo結(jié)合R語言進行流式數(shù)據(jù)降維，最大優(yōu)勢在于可以利用二維平面展示多維流式抗體數(shù)據(jù)，可以更加清晰直觀地展示細胞群抗體表達情況及實驗組和對照組同一抗體的表達差異。同時結(jié)合R語言去除批次效應，可將不同批次的流式數(shù)據(jù)整合到一起分析，極大地提升了流式數(shù)據(jù)的利用率以及所得結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果

2.128色流式細胞組合搭建 28色流式細胞技術(shù)應用于分析人類外周血中淋巴細胞表型。本研究根據(jù)已報道疾病相關蛋白表達情況及部分測序數(shù)據(jù)結(jié)果，結(jié)合現(xiàn)有T細胞相關免疫學知識建立了一套新的28色T細胞相關流式檢測方案(表1、圖1)，不僅包括一系列T細胞亞群的分化標記物(CD45，CD3，CD4，CD8等)，還包括3種TCR(TCR γδ，TCRγ7.2，TCR Vα24-Jα18)[2-5]。在功能方面，一系列趨化因子受體分子，如CXCR家族(CXCR3、CXCR5、CXCR6)，CCR家族(CCR4、CCR6、CCR7)，激活相關分子 (CD69、CD314、HLA-DR)，耗竭相關分子(PD-1等)及細胞成熟與歸巢受體分子(CD45RO,CD103)等也都涵蓋在整個抗體組合中，抗體信息組合見表1[6]。

表1 28色流式抗體信息

圖1 利用FACSymphony分析外周血中免疫細胞亞群差異的流程Fig.1 Schematic overview for analysis of difference of immune cell subsets in peripheral blood by FACSymphony

2.2Ax-SpA患者與健康對照外周血中CD4+T細胞與CD8+T細胞差異分析 獲得數(shù)據(jù)后，經(jīng)過FlowJo結(jié)合R語音進行流式數(shù)據(jù)降維等一系列分析，并輸出可視化結(jié)果。在外周血CD4+T細胞可根據(jù)細胞表面標記分為10個亞群，分別為：Cluster 0～9(圖2A)。相比健康對照，10個細胞亞群的比例并沒有發(fā)生明顯變化(圖2B)。

圖2 CD4+ T細胞在ax-SpA患者與健康人外周血中亞群的比較Fig.2 Comparison of CD4+ T cell subsets in PBMCs between ax-SpA patients and healthy controlsNote:A.CD4+ T cell subsets are divided into 10 clusters (cluster 0-9) based on FACS marker expression level；B.Percentage of cluster 0-9 in ax-SpA patients and healthy controls.

同樣的，對CD8+T細胞的進一步分析得到14個小亞群(圖3A)，對比健康對照，其中Cluster8在ax-SpA患者中比例明顯升高(圖3B)。

圖3 CD8+ T細胞在ax-SpA患者與健康人外周血中亞群的比較Fig.3 Comparison of CD8+ T cell subsets in PBMCs between ax-SpA patients and healthy controlsNote:A.CD8+ T cell subsets are divided into 14 clusters (cluster 0～13) based on FACS marker expression level；B.Percentage of cluster 0～13 in ax-SpA patients and healthy controls.

2.3CD103+CD8+T細胞在ax-SpA患者外周血中比例升高 本研究對殺傷性CD8+T細胞亞群進行了進一步的分析，通過熱圖把每個細胞亞群的各標記蛋白的表達量進行了可視化展示(圖4A)，進一步在t-SNE降維圖中展示跟T細胞駐留相關的分子標記CD69和CD103(圖4B)。

Ax-SpA患者中明顯增高的Cluster8 亞群中，結(jié)合其功能分子的表達進一步分析發(fā)現(xiàn)其主要為一群表達CD103的CD8+T細胞，即在ax-SpA患者中，CD103+CD8+T細胞比例明顯增多。

進一步用傳統(tǒng)流式分析方法驗證了ax-SpA患者與健康對照細胞的比例(圖4C)?？梢园l(fā)現(xiàn)在ax-SpA患者中，CD103+CD8+T比例明顯上升(P<0.05)(圖4D)，這與通過R語言分析得到的結(jié)果一致。

圖4 CD103+CD8+ T細胞在ax-SpA患者外周血中增多Fig.4 CD103+CD8+ T cells are increased in PBMCs of ax-SpA patientsNote:A.Heat map shows expression level of each protein marker；B.CD69 and CD103 expression level in merged CD8+ T cell；C.CD69 and CD103 expression on CD8+ T cell of each ax-SpA patients and healthy controls；D.Percentage of CD103+CD8+ T cells in CD8+ T cells.

3 討論

Ax-SpA是一種慢性的，主要累及脊柱關節(jié)的自身免疫性疾病，其致病機制尚不清楚。有部分文獻報道T細胞HLA-B27基因突變會誘導疾病發(fā)生并對治療效果產(chǎn)生影響[7-9]。區(qū)別于傳統(tǒng)對CD8+T細胞免疫學知識與理解的方法，本文利用R語言聚類分析算法，結(jié)合28色流式細胞術(shù)對于ax-SpA患者及健康對照外周血的T細胞亞群進行了較為細致的分析，CD4+T細胞的10個小亞群中沒有明顯變化，但在CD8+T的14個小亞群中，表達CD103的CD8+T細胞在ax-SpA患者中明顯升高，并對其進行了傳統(tǒng)流式分析方法的驗證。

CD103(也稱為Integrin,alpha E)是一種整合素蛋白，在T細胞歸巢中起到重要作用，被認為是組織駐留免疫細胞的重要標志子[10]。CD103廣泛表達于上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL) T細胞(αβT細胞和γδT細胞)和一些調(diào)節(jié)性T細胞亞群，部分腸道固有層也有T細胞表達[11,12]。有文獻報道，在自身免疫性腸道疾病(IBD)中，腸黏膜中的T細胞高表達整合素E7(E 7 integrin)，并與關節(jié)部位的損傷有密切的聯(lián)系，提示歸巢受體CD103也可能在腸道炎癥相關的關節(jié)炎癥中發(fā)揮作用[13]。在腫瘤免疫微環(huán)境中， CD103+CD39+CD8+T細胞在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤中明顯升高。研究表明，頭頸癌患者CD103+CD39+CD8+T的比例越高，總體生存率也越高[14]，提示CD103+CD8+T細胞在區(qū)域特異性微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。

在治療方面，F(xiàn)DA已經(jīng)批準那他珠單抗阻斷整合素蛋白α4β1 (CD49d，CD29)治療多發(fā)性硬化癥，2016年已有臨床個案報道利用那他珠單抗治療AS并取得了一定效果。這也提示整合素蛋白家族在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，在未來可能通過阻斷CD103來實現(xiàn)對于疾病的干預。

隨著流式細胞術(shù)技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細胞標記技術(shù)已經(jīng)可以實現(xiàn)同時標記數(shù)十種細胞外標志物并在一次實驗完成全部檢測，這對于臨床較少的樣本量下獲得更多的信息非常重要。2018年以來，文獻陸續(xù)報道28色流式細胞技術(shù)應用于分析人類外周血中淋巴細胞的表型[15,16]。此研究通過搭建多通道(28色)流式細胞術(shù)檢測平臺，應用R語言，大數(shù)據(jù)可視化分析了ax-SpA患者外周血中T細胞兩個大亞群CD4+T細胞、CD8+T細胞下的24個亞群比例及功能蛋白分子表達量，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，ax-SpA患者中的CD103+T細胞比例明顯上升，這可能為未來臨床工作中ax-SpA的診斷和治療起到一定的啟示。

致謝：感謝BD公司Total solution團隊張新梅、鐘娜、姚丹丹、石丹露在28色方案設計、方法學優(yōu)化等方面提供的幫助。