嵌合性抗ROR1抗體Fab片段的制備及鑒定

殷鄭娜 梅思偉 蔣秀敏 張寧芝

(阜陽市人民醫(yī)院，阜陽 236000)

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1，ROR1)在進(jìn)化上具有保守性，僅在胚胎發(fā)育早期有顯著表達(dá)[1,2]，在正常成人組織中鮮有表達(dá)。ROR1參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、血管生成及代謝信號傳導(dǎo)等多種功能，同時在細(xì)胞間相互作用以及各器官和組織胚胎發(fā)育早期發(fā)揮重要作用[1,3]。研究表明，ROR1在多種人類腫瘤組織中異常表達(dá)[4-11]。在卵巢癌和乳腺癌中，ROR1通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的基因表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性，導(dǎo)致其不良預(yù)后[12-14]。本團(tuán)隊前期的研究中證實卵巢癌組織中ROR1的表達(dá)量顯著高于正常卵巢組織，并發(fā)現(xiàn)ROR1是卵巢癌的獨立預(yù)后因素[8]。為探討ROR1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究制備了抗ROR1抗體Fab片段，并初步探討該抗體與卵巢腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合能力，為進(jìn)一步探究ROR1的作用機(jī)制及抗體腫瘤靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 重組人ROR1蛋白(Sino Biological Inc，中國)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記羊抗人Fab抗體(Sigma，美國)；8周齡BALB/c雌性小鼠(上海斯萊克動物實驗有限責(zé)任公司，中國)；骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(本實驗室保存)；DMEM 培養(yǎng)基 、RPMI1640 培養(yǎng)基 、胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素、次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)、氨基蝶呤(A)(Gibco，美國)；大腸桿菌DH5-α、E.coliBL21(南京全式金生物有限公司，中國)；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工生物工程股份有限公司，中國)；FITC標(biāo)記羊抗人Fab抗體、商品化抗ROR1抗體(Abcam，英國)；限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、kpnⅠ、NcoⅠ和HindⅢ(Thermo，美國)，DNA連接酶、pMD18-T Vector、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；pcomb3Xλ質(zhì)粒及pETDUET-1原核表達(dá)載體為本實驗室保存；protein L柱、AKTA蛋白純化儀(GE，美國)，10 kD超濾離心管、30 kD超濾離心管(Millipore，美國)；RNA提取試劑盒(飛捷,中國)；HO8910細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫及細(xì)胞融合 將重組人ROR1抗原與等體積弗氏佐劑乳化，共振30 min后皮下免疫或腹腔免疫BALB/c雌性小鼠，共免疫3次，每次間隔兩周，檢測小鼠體內(nèi)抗ROR1抗體效價，選取抗體效價最高的小鼠，加強(qiáng)免疫一次，3 d后，無菌取該免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞融合，于HAT選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)11 d。以重組人ROR1抗原包被96孔板，ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞分泌上清，以篩選陽性雜交瘤。初篩陽性孔經(jīng)過3次亞克隆，篩選分泌抗ROR1抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 37℃、5% CO2條件下，將HO8910細(xì)胞置于含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0置于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，融合細(xì)胞置于HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.3引物設(shè)計與合成 利用本實驗室設(shè)計通用引物[15]PCR擴(kuò)增ROR1抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)及恒定區(qū)，PCR結(jié)果陽性的克隆送公司測序，測序結(jié)果比對VBASE2 數(shù)據(jù)庫分析，進(jìn)而得到抗體可變區(qū)和恒定區(qū)的核酸及氨基酸序列，依據(jù)重疊延伸PCR原理，設(shè)計抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)引物如下：VH-F：5′-CATATGCAGGTGCAGCTGGTGCA-GTCTG-3′； VH-R：5′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3′；VL-F：5′-CCATGG-GCGAGCTCGTGATGACCCAG-3′；VL-R：5′-CAGCCTTGGGCTGACCTTTTATTTCCAACTTTGTC-3′；CH-F：5′-GAACCCTGGTCACCGTCTCCGCCTCCACCAAGG-GCCCA-3′； CH-R：5′-GGTACCTTAAGAAGCGTAG-TCCGGAAC-3′；CL-F：5′-GACAAAGTTGGAAATAAAAGGTCAGCCCAAGGCTG-3′；CL-R：5′-AAGCTTTTATGAACATTCTGTAGGGGCCACT-3′。

1.2.4原核表達(dá)系統(tǒng)抗ROR1抗體Fab段的構(gòu)建及鑒定 將篩選分泌抗ROR1抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄獲取單鏈cDNA。以cDNA為模板，利用本實驗室設(shè)計通用引物分別PCR擴(kuò)增得到抗ROR1抗體輕重鏈的可變區(qū)[15]。以pComb3Xλ質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到抗體輕重鏈的CL和CH1片段，將PCR產(chǎn)物分別經(jīng)電泳回收純化，以純化的產(chǎn)物為模板，設(shè)計引物，分別合成抗體的輕鏈(L)和重組重鏈(Fd)。

合成的抗體的輕鏈和重組重鏈分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ/HindⅢ和NdeⅠ/kpnⅠ在37℃水浴鍋中酶切2 h，經(jīng)電泳回收純化后，通過DNA連接酶依次連接到表達(dá)載體pETDUET-1上，得重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定及測序檢驗，證實不存在堿基突和氨基酸序列變化。

1.2.5抗ROR1抗體Fab段的表達(dá)和純化 將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pETDUET-1轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliBL21中，并接種于氨芐霉素抗性的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，篩選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1∶1 000 比例加入IPTG，于16℃搖床過夜誘導(dǎo)表達(dá)，收菌，經(jīng)超聲破菌后，留取沉淀和上清，SDS-PAGE及Western blot檢測蛋白表達(dá)。超聲上清經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，通過AKTA蛋白純化儀和protein L柱純化[16]。收集的蛋白樣品置于分子量10 kD的超濾管中，4℃下4 000 r/min離心30 min，重復(fù)3次置換洗脫液，獲取濃縮蛋白，分光光度計測量蛋白濃度，保存于-80℃冰箱。

1.2.6Western blot 將純化的抗ROR1抗體Fab段經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，3%的BSA封閉硝酸纖維素膜2 h，HRP標(biāo)記的特異性羊抗人Fab抗體封閉1 h，TBST清洗3次后化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.7抗ROR1抗體Fab段的免疫學(xué)特性分析

1.2.7.1ELISA ROR1蛋白包被96孔板，4℃冰箱過夜，3% BSA 37℃封閉2 h，PBST清洗3次，將抗ROR1抗體Fab段梯度稀釋加入96孔包被板，37℃溫箱孵育1 h，PBST清洗3次，加入HRP標(biāo)記的特異性羊抗人Fab抗體，37℃溫箱孵育1 h，PBST清洗3次，每孔加入100 μl TMB顯色液，避光10 min，75 μl 2 mol/L濃硫酸終止顯色后檢測OD450值。商品化抗ROR1抗體作為陽性對照。

1.2.7.2流式細(xì)胞術(shù) 將HO8910細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細(xì)胞經(jīng)消化、洗滌后分3管，分別為1號管(Blank組)、2號管(只加熒光二抗組即FITC組)及3號管(實驗組即ROR1-Fab組)，5% 脫脂牛奶、37℃溫箱封閉1 h，PBS清洗后，1號管和 2號管加入PBS；3號管加入抗ROR1抗體Fab段，均置于37℃溫箱孵育1 h，PBS清洗后1號管中加入PBS； 2號管和3號管分別加入FITC標(biāo)記羊抗人Fab抗體；室溫避光孵育1 h。PBS清洗后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.7.3免疫熒光 將HO8910細(xì)胞接種至6孔板中，分為ROR1-Fab組和對照組，待細(xì)胞密度生長至80%，用4%多聚甲醛固定，5% 脫脂牛奶封閉1 h，于ROR1-Fab組加入ROR1-Fab抗體室溫孵育2 h，對照組加入等量PBS，PBS清洗后于兩組加入FITC標(biāo)記羊抗人Fab抗體封閉1 h，DAPI染細(xì)胞核后熒光顯微鏡分析。

2 結(jié)果

2.1原核表達(dá)嵌合性抗ROR1抗體Fab段質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 實驗成功獲得分泌抗ROR1抗體的陽性克隆細(xì)胞株，提取該細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA。以此cDNA為模板，PCR擴(kuò)增嵌合性抗ROR1抗體Fab段輕重鏈的可變區(qū)，大小均約為400 bp；以pcomb3Xλ質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增抗體輕重鏈的恒定區(qū)，大小分別約為350 bp和400 bp。利用重疊延伸PCR，將抗體可變區(qū)和恒定區(qū)分別連接，得到輕鏈L和重組重鏈Fd，大小分別約為750 bp和800 bp(圖1)。得到的輕鏈L和重組重鏈Fd，分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ/HindⅢ和NdeⅠ/kpnⅠ酶切后，與原核表達(dá)載體pETDUET-1連接，得重組表達(dá)質(zhì)粒，即原核表達(dá)抗ROR1抗體Fab段質(zhì)粒成功構(gòu)建。 經(jīng)酶切驗證及測序檢驗，證實不存在堿基突變和氨基酸序列變化。酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的條帶與輕鏈和重鏈大小相同(圖2)。

圖1 PCR擴(kuò)增嵌合性抗ROR1抗體Fab段輕鏈和重鏈Fig.1 PCR amplification of chimeric anti-ROR1 Fab antibody light and heavy chainsNote:M.DNA marker;1.Variable region of light chain;2.Conserved region of light chain;3.Light chain;4.Variable region of heavy chain;5.Conserved region of heavy chain;6.Heavy chain.

圖2 原核表達(dá)嵌合性抗ROR1抗體Fab段質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of chimeric anti-ROR1 Fab antibody plasmids by prokaryotic expressionNote:M.DNA marker;1.Plasmid of pETDuet-1 without restriction endo-nuclease digestion;2.Plasmid of pETDuet-1 combined with the light chain (pETDuet-L);3.NcoⅠ/HindⅢ were used for double digesting the pETDuet-L plasmid;4.Plasmid of pETDuet-1 combined with the heavy and heavy chains (pETDuet-L-H);5.NdeⅠ/kpnⅠ were used for double digestion of the pETDuet-L-H plasmid.

2.2嵌合性抗ROR1抗體Fab段的表達(dá)與純化 SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，約27 kD處可見明顯條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌條帶明顯比未用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌亮，超聲上清中條帶明顯比超聲沉淀的亮(圖3)，證明蛋白主要于胞漿中表達(dá)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)本實驗制備抗體輕鏈為К型，選用protein L柱純化，超聲破菌上清經(jīng)純化、濃縮后，得抗體終濃度為0.9 mg/ml。SDS-PAGE和Western blot用于純化抗體的驗證：在約27 kD處可見明顯條帶，與表達(dá)抗體大小符合(圖4)。

圖3 嵌合性抗ROR1抗體Fab段的表達(dá)Fig.3 Expression of chimeric anti-ROR1 Fab antibodyNote:A.SDS-PAGE；B.Western blot.1.Sediment of sonicated lysate of E.coli induced by IPTG;2.Supernatant of sonicated lysate of E.coli induced by IPTG;3.Sediment of sonicated lysate of E.coli;4.Supernatant of sonicated lysate of E.coli;M.DNA marker.

圖4 嵌合性抗ROR1抗體Fab段的純化產(chǎn)物Fig.4 Purified product of chimeric anti-ROR1 Fab antibodyNote:A.SDS-PAGE；B.Western blot.

2.3ELISA嵌合性抗ROR1抗體Fab段能特異性結(jié)合抗原ROR1 ELISA法檢測抗ROR1抗體Fab段和ROR1蛋白的結(jié)合能力，結(jié)果顯示嵌合性抗ROR1抗體Fab段能特異性結(jié)合抗原ROR1，具有量效關(guān)系(圖5)。

圖5 ELISA檢測嵌合性抗ROR1抗體Fab段與ROR1的特異性結(jié)合Fig.5 Chimeric anti-ROR1 Fab antibody specific bind ROR1 was evaluated by ELISANote:Serial dilutions of the chimeric anti-ROR1 Fab antibody were used as the first antibody for ELISA and HRP-conjugated goat anti-human antibody (Fab specific) was used as the secondary antibody.Blank.PBS；Ctrl.Commercial anti-ROR1 antibody was used as a positive control.*.P<0.05,***.P<0.001.

2.4流式細(xì)胞術(shù)驗證抗ROR1抗體Fab段與卵巢癌HO8910細(xì)胞特異性結(jié)合 流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合性抗ROR1抗體Fab段與卵巢癌HO8910細(xì)胞的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，抗ROR1抗體Fab段可特異性結(jié)合到卵巢癌HO8910細(xì)胞表面，證明卵巢癌HO8910細(xì)胞有ROR1蛋白的表達(dá)(圖6)。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)證明抗ROR1抗體Fab段能特異性結(jié)合于卵巢癌HO8910細(xì)胞表面Fig.6 Specific binding of anti-ROR1 antibody Fab to ovarian cancer HO8910 cells by Flow cytometry

2.5免疫熒光驗證抗ROR1抗體Fab段與卵巢癌HO8910細(xì)胞特異性結(jié)合 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，嵌合性抗ROR1抗體Fab可特異性結(jié)合到表達(dá)ROR1蛋白的HO8910細(xì)胞表面(圖7)。

圖7 免疫熒光檢測抗ROR1抗體Fab段能特異性結(jié)合于卵巢癌HO8910細(xì)胞表面Fig.7 Specific binding ability of anti-ROR1 antibody Fab to ovarian cancer HO8910 cells by immunofluore-scence staining

3 討論

通過小鼠免疫、細(xì)胞融合技術(shù)及亞克隆篩選，成功篩選出分泌抗ROR1抗體的陽性融合單細(xì)胞株，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因工程技術(shù)，將PCR擴(kuò)增得到抗體的輕鏈可變區(qū)與恒定區(qū)連接，將重鏈可變區(qū)與恒定區(qū)連接，獲取抗體輕鏈L和重鏈Fd，進(jìn)而將L和Fd連接到原核表達(dá)載體pETDuet1上，成功構(gòu)建表達(dá)抗ROR1抗體Fab段的重組質(zhì)粒。通過將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)中誘導(dǎo)表達(dá)，得到嵌合性抗ROR1抗體Fab，經(jīng)純化后-80℃保存。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的抗體主要存在于菌液的上清即細(xì)胞胞漿中，避免了抗體的變性和復(fù)性，有利于抗體的獲取和純化，有效保證了抗體的生物活性，分子量約為27 kD。本研究利用基因工程技術(shù)成功將人源抗體恒定區(qū)與鼠源抗體可變區(qū)相結(jié)合，將抗體人源化，在保留與抗原高親和力和高特異性的基礎(chǔ)上，大大減少了鼠源性成分在機(jī)體引起的免疫排斥反應(yīng)[17]。

卵巢癌是最常見的女性癌癥之一，盡管目前相關(guān)檢查方法和治療方案已有明顯進(jìn)步，但由于發(fā)病早期的無癥狀和有效腫瘤標(biāo)志物的缺乏，多數(shù)卵巢癌患者確診時已處于晚期階段，預(yù)后較差。單克隆抗體現(xiàn)已被廣泛用于腫瘤的臨床診斷和治療，分子靶向治療作為一種新型的治療手段，以其特異性強(qiáng)、副作用小的優(yōu)點，廣受研究者們的青睞。

本團(tuán)隊前期研究證實ROR1蛋白高表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞表面，作為RTK家族的成員，ROR1具有腫瘤相關(guān)抗原(TAAs)的特性，研究表明ROR1表達(dá)與癌癥密切相關(guān)[8,18]。最近，Zhang等[13]報道一種人源化抗ROR1單克隆抗體抑制乳腺癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，并降低了Rho-GTPases，Hippo-YAP/TAZ或BMI1的活化。Liu等[19]構(gòu)建了一種新的ROR1抑制劑ARI-1，抑制了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。以上表明，針對ROR1的靶向治療是一種很有前景的癌癥治療策略。本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的抗ROR1抗體Fab段重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)純化得到抗ROR1抗體Fab段，其可與ROR1抗原結(jié)合，且具有高度特異性和高度親和力。此外，流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光驗證了嵌合性抗ROR1抗體Fab段能與表達(dá)ROR1蛋白的卵巢癌HO8910細(xì)胞的特異性結(jié)合，這為進(jìn)一步探究ROR1的作用機(jī)制及卵巢癌分子靶向治療奠定了基礎(chǔ)。