shRNA沉默CCAT2通過抑制自噬對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549化療敏感性的影響①

喬 飛 崔凌燕 楊東明 陳鴻運(yùn) 徐萌博

(南陽(yáng)醫(yī)專第一附屬醫(yī)院胸外科，南陽(yáng) 473000)

肺癌是發(fā)病率最高的癌癥之一，并且是世界范圍內(nèi)癌癥致死的主要原因。其中非小細(xì)胞肺癌占比約為85%，吸煙是該病的主要危險(xiǎn)因素，而大氣污染和輻射也是主要誘因[1]。非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、肺泡細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等，近年來(lái)盡管非小細(xì)胞肺癌分子機(jī)制方面的研究取得了進(jìn)展，治療方法有所改進(jìn)，但由于缺乏有效的診斷措施，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，生存率較低[2,3]。非小細(xì)胞肺癌的治療主要通過手術(shù)和化療，目前的一線治療方案是以順鉑為主聯(lián)合其他藥物的治療[4]。然而腫瘤細(xì)胞的耐藥性嚴(yán)重影響了抗腫瘤化療藥物的療效[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，可以從染色體修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯、翻譯后修飾等水平參與基因表達(dá)調(diào)控，lncRNA可為癌癥治療提供新的診斷標(biāo)志物以及靶向治療位點(diǎn)[6,7]。lncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2(colon cancer-associated transcript-2,CCAT2)在多種腫瘤中異常表達(dá)，研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中CCAT2與癌細(xì)胞對(duì)基于順鉑的化療敏感性存在一定的關(guān)聯(lián)，但其準(zhǔn)確作用及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[8]。本研究通過培養(yǎng)人源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549耐順鉑細(xì)胞株，并沉默其CCAT2基因表達(dá)，探討CCAT2對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/DDP化療敏感性的影響，分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549及A549耐順鉑細(xì)胞株(A549/DDP)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；順鉑(cisplatin,DDP)購(gòu)自山東齊魯制藥廠；Hoeschst染色液、CCK8試劑、RIPA裂解液、Trizol試劑、Ecl顯色液、BCA試劑盒、青鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物；lipofectamine2000、CCAT2 scramble和CCAT2 shRNA購(gòu)自上海吉瑪公司，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活性半胱天冬酶3(Cleave caspase-3,cl-caspase-3)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(Microtubulesas sociated protein light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ、Beclin1、p62抗體購(gòu)自NEB公司，所用引物由Primer3 Input設(shè)計(jì)，上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，補(bǔ)充10%胎牛血清，100 U/ml青鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2、37℃。細(xì)胞增殖到80%時(shí)，胰酶消化重懸細(xì)胞，1∶5 傳代繼續(xù)培養(yǎng)。其中A549/DDP培養(yǎng)液中還需加入終濃度5 μmol/L的DDP維持耐藥性。

1.2.2分組及處理方法 A549/DDP細(xì)胞株分為A549/DDP組、Scramble組、CCAT2 shRNA組，按照轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin2000的操作說明，使用CCAT2 scramble和CCAT2 shRNA分別轉(zhuǎn)染Scramble和CCAT2 shRNA組A549/DDP細(xì)胞，A549/DDP組細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)，循環(huán)條件為：95℃ 2 min預(yù)變性，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各組mRNA水平，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔100 μl。5%CO2、37℃預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別加入0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L的DDP處理48 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值并計(jì)算DDP的IC50值，后續(xù)采用IC50值作為給藥濃度。

1.2.5Hoeschst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài) 根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞后，接種細(xì)胞于6孔板中，4%多聚甲醛固定細(xì)胞并通過0.5% TrintonX-100透膜處理，滴加Hoeschst熒光染料進(jìn)行細(xì)胞染色30 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞，每組細(xì)胞加入150 μl binding buffer和5 μl Annexin-V-FITC，混勻，暗室室溫孵育15 min，再加入100 μl binding buffer和5 μl PI混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 根據(jù)1.2.2的方法處理細(xì)胞后，RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒對(duì)各組細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行定量，每組取 30 μg 蛋白，加入SDS-PAGE點(diǎn)樣孔中，10% SDS-PAGE分離各組蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶在室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，PBS清洗3次后加入二抗室溫繼續(xù)孵育2 h，Ecl顯色液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1CCAT2在耐藥性A549細(xì)胞株中高表達(dá)及shRNA抑制CCAT2表達(dá) 如圖1所示，A549/DDP細(xì)胞株CCAT2表達(dá)水平顯著高于A549細(xì)胞株(P<0.01)。同時(shí)，與A549/DDP組相比，Scramble組CCAT2表達(dá)水平無(wú)明顯差異，CCAT2 shRNA組CCAT2表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 RT-PCR檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞中CCAT2的表達(dá)水平Fig.1 CCAT2 expression level in A549/DDP cells detected by RT-PCRNote:##.P<0.01 versus A549 and A549/DDP group.

2.2沉默CCAT2抑制A549/DDP細(xì)胞株對(duì)DDP的耐藥性 如圖2所示，與A549/DDP組相比，Scramble組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CCAT2 shRNA組細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A549/DDP組、Scramble組和CCAT2shRNA組IC50分別為(66.37±7.79)μmol/L、(63.50±8.33)μmol/L、(22.33±4.32)μmol/L。

圖2 CCK-8檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞在不同濃度DDP處理下的細(xì)胞活性Fig.2 Cell viability under different concentrations of DDP in A549/DDP cells detected by CCK-8Note:#.P<0.05 versus A549/DDP group.

2.3沉默CCAT2促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞株細(xì)胞凋亡 如圖3所示，與A549/DDP組相比，Scramble組形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異，CCAT2 shRNA組細(xì)胞染色質(zhì)聚集，染色加深，有較多DNA熒光碎片，同時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 Hoeschst及流式檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞凋亡(×400)Fig.3 Cell apoptosis in A549/DDP cells detected by Hoeschst and flow cytometry(×400)Note:##.P<0.01 versus A549/DDP group.

2.4沉默CCAT2對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 如圖4所示，與A549/DDP組相比，Scramble組Bax、Bcl-2和cl-caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CCAT2 shRNA組Bax、cl-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of apoptosis-related protein in A549/DDP cells detected by Western blotNote:##.P<0.01 versus A549/DDP group.

2.5沉默CCAT2對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 如圖5所示，與A549/DDP組相比，Scramble組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Beclin1和p62蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CCAT2 shRNA組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著降低，p62蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CCAT2 shRNA+Baf-A1組和CCAT2 shRNA組水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 Western blot檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of autophagy related protein in A549/DDP cells detected by Western blotNote:##.P<0.01 versus A549/DDP group.

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種新型的基因治療技術(shù)，通過特異性靶向作用阻斷目的基因表達(dá)，抑制腫瘤信號(hào)基因傳導(dǎo)，從而發(fā)揮基因治療的作用[9]。目前最常用的RNAi研究策略是small interfering RNA(siRNA)和short hairpin RNA(shRNA)，shRNA在細(xì)胞內(nèi)可通過Dicer酶等作用，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的siRNA，從而干擾目的基因表達(dá)，相比于siRNA在細(xì)胞內(nèi)具有更為穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，可持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)[10]。

CCAT2與多種癌癥的進(jìn)程密切相關(guān)，其中包括非小細(xì)胞肺癌，研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，CCAT2可通過不同的機(jī)制調(diào)控腫瘤的形成、增殖和轉(zhuǎn)移[11-13]。Gong等[8]通過基因分型的方法，發(fā)現(xiàn)CCAT2可能與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549基于順鉑的化療敏感性存在著一定關(guān)聯(lián)，但其影響和作用機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究首先檢測(cè)了CCAT2在A549和A549/DDP細(xì)胞株中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在A549/DDP中CCAT2表達(dá)水平顯著升高，表明A549/DDP細(xì)胞株對(duì)DDP的化療敏感性可能與CCAT2存在關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步證實(shí)CCAT2與DDP化療敏感性的相互關(guān)系，本研究通過shRNA沉默了A549/DDP細(xì)胞株中CCAT2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默CCAT2大幅降低了A549/DDP細(xì)胞在DDP處理下的細(xì)胞活力，并且細(xì)胞活力下降水平呈DDP劑量依賴性，表明A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性與CCAT2有關(guān)，沉默CCAT2會(huì)導(dǎo)致A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增加。

DDP是一種被廣泛應(yīng)用于各種癌癥治療的化療藥物，其作用機(jī)制是通過與DNA的嘌呤堿基發(fā)生交聯(lián)，從而干擾DNA修復(fù)，造成DNA損傷，抑制細(xì)胞有絲分裂，并進(jìn)一步導(dǎo)致癌癥細(xì)胞凋亡，在肺癌化療及輔助治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默CCAT2會(huì)導(dǎo)致A549/DDP的凋亡水平顯著升高，表明沉默CCAT2可提高A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的化療敏感性，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2是線粒體凋亡通路的關(guān)鍵分子，其中Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，兩者是衡量細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡的重要標(biāo)志[15]。各種細(xì)胞凋亡途徑，最終需要激活caspase酶才能引起細(xì)胞的凋亡[16]，其中cl-Caspase-3是該家族中的執(zhí)行因子，直接參與一系列關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的特異性裂解[17]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默CCAT2導(dǎo)致Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)cl-caspase-3表達(dá)水平也顯著升高，表明沉默CCAT2誘導(dǎo)了癌細(xì)胞凋亡，與既往研究結(jié)果相符。

自噬是真核生物細(xì)胞普遍存在的生理機(jī)制，自噬過程中，自噬體與溶酶體融合，進(jìn)而降解細(xì)胞中受損的蛋白分子和細(xì)胞器，并循環(huán)利用其降解產(chǎn)物，維持細(xì)胞的代謝平衡[18]。研究表明，自噬在腫瘤細(xì)胞中是促進(jìn)細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵因素，抑制細(xì)胞的保護(hù)性自噬可增加腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性[19,20]。LC3Ⅰ在自噬發(fā)生時(shí)，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ始終定位于自噬體膜上，是自噬體的標(biāo)志分子[21]。Beclin1是自噬特異性基因，參與了自噬起始，可直接調(diào)控自噬發(fā)生水平[22]。p62結(jié)合泛素化蛋白，進(jìn)入自噬體并最終在自噬溶酶體中被降解[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默CCAT2導(dǎo)致LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達(dá)水平顯著降低，p62表達(dá)水平升高。進(jìn)一步通過自噬下游抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,Baf-A1)處理發(fā)現(xiàn)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62水平均無(wú)顯著變化，Baf A1具有抑制自噬體和溶酶體結(jié)合的作用，在自噬體正常合成時(shí)會(huì)導(dǎo)致LC3Ⅱ過度積累，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ升高；當(dāng)自噬體合成受抑制時(shí)，LC3Ⅱ水平不會(huì)在Baf A1處理的基礎(chǔ)上發(fā)生改變[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默CCAT2可抑制A549細(xì)胞的保護(hù)性自噬，降低自噬體的合成，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

綜上所述，A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性與CCAT2有關(guān)，沉默CCAT2的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高，促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3表達(dá)水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Beclin1和p62表達(dá)水平均顯著下降，并且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平受Baf A1處理影響微弱，表明沉默CCAT2會(huì)阻斷自噬體的合成，從而抑制A549/DDP細(xì)胞的保護(hù)性自噬作用。本研究初步探討了CCAT2在A549/DDP細(xì)胞的DDP耐藥性中的影響及作用機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌治療提供了新的潛在治療靶點(diǎn)，今后將進(jìn)一步研究CCAT2在DDP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和自噬中的具體機(jī)制。