長鏈非編碼RNA XIST通過miR-186調控宮頸癌細胞侵襲遷移及凋亡的分子機制①

徐 倩 楊根嶺 張 波 萬 斌 張 瑜

(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院，重慶 401331)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤，目前主要活療手段為手術治療及放、化療，由于手術治療的局限性及放、化療的毒副作用，基因治療成為研究熱點[1]。宮頸癌的發(fā)生與基因調控相關，基因參與腫瘤細胞侵襲遷移等過程，因此，研究宮頸癌發(fā)病機制、尋找有效靶基因備受關注[2]。XIST是機體中有廣泛生物學作用的lncRNA，是哺乳動物X染色體失活的調控因子，參與基因組功能發(fā)揮、細胞分化等過程[3]。XIST異常表達可能與腫瘤發(fā)生相關，高表達XIST的肺癌、前列腺癌等腫瘤細胞惡性程度較高，敲低XIST可抑制腫瘤細胞侵襲并誘導凋亡[4,5]。宮頸癌細胞中XIST表達水平高于癌旁組織，與腫瘤轉移、病理分期等相關[6]。本研究以明確XIST在宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡中的作用為目的，探討其機制，為靶向基因治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人宮頸癌CaSki細胞購自通派(上海)生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；XIST shRNA和shRNA control購自長沙贏潤生物技術有限公司；miR-186 inhibitor、inhibitor control購自廣州市銳博生物科技有限公司；miR-186 mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥技術有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Cleaved Caspase-3抗體、MMP-2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；MMP-9抗體購自美國Bio Vision公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 CaSki細胞接種于6孔板，細胞融合度為60%時用轉染試劑Lipofectamine 2000將XIST shRNA和shRNA control轉染至細胞中。將轉染XIST shRNA和shRNA control后的細胞記為sh-XIST和sh-NC，未轉染細胞為Control。

1.2.2qRT-PCR檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞中XIST表達的影響 Control、sh-NC、sh-XIST組細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別提取總RNA，All-in-oneTMFrist-Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，步驟同試劑盒說明書。引物序列為：XIST F：5′-CAGACGTGTGCTCTTC-3′R：5′-CGATCTGTAAGTCCA-CCA-3′, GAPDH F：5′-AACGTGTCAGTGGTGGACC-TG-3′，R：5′-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。合成的cDNA用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒擴增，2-ΔΔCt法計算XIST表達變化。

1.2.3流式細胞術檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞凋亡的影響 各組細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，以1×Binding Buffer細胞，調整細胞濃度為1×107個/ml。收集1 ml細胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入Binding Buffer 500 μl，Annexin V-FITC和PI染液孵育15 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.2.4Transwell小室實驗檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞侵襲和遷移的影響 Transwell小室上室添加不含血清的細胞培養(yǎng)液懸浮的細胞200 μl，下室添加含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液500 μl，置于培養(yǎng)箱中孵育48 h，將培養(yǎng)板取出，PBS洗滌，添加4%多聚甲醛溶液在室溫中孵育30 min，結晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞穿膜數量即為細胞遷移數目。侵襲實驗前2 h添加Matrigel濕化小室，其余步驟同遷移實驗。

1.2.5Western blot檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 各組細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，添加RIPA裂解液及蛋白酶、磷酸酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，低溫高速離心10 min。取上清，BCA法定量檢測蛋白。分別配制分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，每孔添加30 μg蛋白樣品，90 V恒壓電泳，肉眼可見溴酚藍進入到凝膠底部后停止電泳，4℃、70 V電壓下轉移至NC膜，轉膜時間為60 min。NC膜于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，置于一抗反應液(Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9以1∶400稀釋)中4℃過夜，加入1∶2 000稀釋的二抗，加入室溫孵育2 h，ECL法化學發(fā)光。記錄目的條帶Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9及內參條帶GAPDH灰度值，分析目的蛋白表達水平。

1.2.6靶基因預測和鑒定 Starbase軟件預測XIST與miR-186互補結合位點，將XIST互補結合位點突變，構建突變型熒光素酶報告載體(XIST-MUT)及野生型熒光素酶報告載體(XIST-WT)，Lipofectamine 2000分別將XIST-MUT、XIST-WT和miR-186 mimics、mimics control共轉染至CaSki細胞，培養(yǎng)48 h，熒光素酶活性測定試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7qRT-PCR檢測XIST shRNA對宮頸癌細胞miR-186表達的影響 各組細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照1.2.2各組測定細胞miR-186表達變化，評估XIST對miR-186的調控作用，內參為U6，引物為：U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACG-CTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-186 F：5′-CGACGCGT-CGGTTTACAGAACAGGGATCA-3′，R：5′-CCATCGATGGGGCACAGCAACAAAAGACT-3′。

1.2.8miR-186 inhibitor對XIST shRNA影響宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響 Lipofectamine 2000分別將inhibitor control、XIST shRNA和miR-186 inhibitor、XIST shRNA共轉染至CaSki細胞，記為sh-XIST+Anti-NC和sh-XIST+Anti-miR-186，培養(yǎng) 48 h，qRT-PCR檢測細胞miR-186表達變化，流式細胞術檢測細胞凋亡，Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移，Western blot檢測細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。

2 結果

2.1XIST shRNA抑制宮頸癌細胞XIST表達 宮頸癌細胞中轉染XIST shRNA后，XIST表達水平明顯降低(P<0.01)，說明XIST shRNA可抑制宮頸癌細胞XIST表達，見表1。

表1 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞中 XIST表達變化

2.2下調XIST對宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響 轉染XIST shRNA后宮頸癌細胞凋亡率升高，細胞侵襲和遷移數目降低，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞侵襲和遷移，誘導細胞凋亡，見圖1、表2。

圖1 流式細胞術檢測XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞凋亡Fig.1 Detection of apoptosis in cervical camcer cells after transfection with XIST shRNA by folw cytometry

表2 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞凋亡率、細胞侵襲和遷移數目

2.3下調XIST對宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 轉染XIST shRNA后，宮頸癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達并促進Cleaved Caspase-3表達，見圖2、表3。

圖2 Western blot檢測XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平Fig.2 Expressions of Cleaved Caspase-3,MMP-2 and MMP-9 in cervical cancer cells after XIST shRNA transfection by Western blot

表3 XIST shRNA轉染后宮頸癌細胞中Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9蛋白水平

2.4XIST靶向調控miR-186 Starbase軟件預測到miR-186與XIST存在互補結合位點，XIST-WT與miR-186 mimics共轉染下調宮頸癌細胞熒光素酶活性，XIST靶向調控miR-186，見圖3、表4。

圖3 Starbase軟件預測miR-186與XIST互補結合位點Fig.3 Prediction of complementary binding sites between miR-186 and XIST by Starbase software

表4 熒光素酶報告載體鑒定靶向關系

2.5XIST shRNA提高宮頸癌細胞miR-186表達 轉染XIST shRNA后宮頸癌細胞miR-186表達水平升高，說明下調XIST可促進宮頸癌細胞miR-186表達，見表5。

表5 XIST shRNA對宮頸癌細胞miR-186表達的影響

2.6下調miR-186對XIST shRNA抑制宮頸癌細胞侵襲遷移和誘導凋亡的影響 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染可下調宮頸癌細胞miR-186表達，減少細胞凋亡并促進宮頸癌細胞侵襲和遷移(P<0.05)，說明miR-186 inhibitor可逆轉XIST shRNA對宮頸癌細胞侵襲遷移和凋亡的影響，見圖4、表6。

圖4 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染對宮頸癌細胞凋亡和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達影響Fig.4 Effect of co-transfection of miR-186 inhibitor and XIST shRNA on apoptosis and Cleaved Caspase-3,MMP-2,MMP-9 expressions of cervical cancer cellsNote:1.sh-XISF+Anti-NC;2.sh-XIST+Anti-miR-186.

表6 miR-186 inhibitor和XIST shRNA共轉染后宮頸癌細胞凋亡、侵襲遷移和Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達變化

3 討論

本研究發(fā)現XIST表達降低后宮頸癌細胞凋亡率提高，細胞侵襲和遷移能力下降，說明下調XIST可抑制宮頸癌細胞生長，XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點。本研究進一步明確了XIST的作用機制，發(fā)現miR-186可靶向結合XIST，XIST表達下調可提高細胞miR-186表達，抑制miR-186表達可逆轉XIST下調對宮頸癌細胞的抵抗作用，證明下調XIST可靶向提高miR-186誘導宮頸癌細胞凋亡和抑制細胞侵襲遷移。

lncRNA是新近發(fā)現的非編碼RNA，其表達具有組織、空間或時間特異性，參與干細胞激活、細胞凋亡、細胞分化等生物學過程，與腫瘤的關系備受關注[7-9]。XIST只能從失活的X染色體中轉錄，與人類基因組維護、細胞凋亡等有關，可通過影響染色質的穩(wěn)定調控基因表達[10-12]。XIST參與腫瘤進展，在腫瘤組織中異常表達與腫瘤惡性程度相關，在肺癌、胃癌、上皮性卵巢癌等腫瘤中已經發(fā)現其可發(fā)揮類似癌基因的作用促進腫瘤進展[13-15]。XIST可促進胰腺癌細胞生長，在前列腺癌中發(fā)揮癌基因作用，下調XIST可抑制肺癌細胞侵襲和遷移，表明XIST可促進腫瘤惡性進展，與前人研究結果一致，因此，靶向抑制XIST可能是宮頸癌治療途徑之一[5,16,17]。

Cleaved Caspase-3是細胞凋亡的標志因子，Caspase-3是Caspase凋亡反應中的下游執(zhí)行子，活化后形成Cleaved Caspase-3促進細胞凋亡[18]。MMP-2和MMP-9均屬于基質金屬蛋白酶家族，可降解細胞外基質，促進腫瘤轉移[19]。miR-186在腫瘤中低表達，可抑制宮頸癌細胞侵襲和遷移，抑制宮頸癌惡性進展[20]。本研究證實XIST下調可抑制宮頸癌細胞MMP-9和MMP-2蛋白表達，并促進Cleaved Caspase-3蛋白表達，此作用機制與靶向負調控miR-186表達相關，下調XIST可通過促進宮頸癌細胞miR-186表達減少細胞合成MMP-9、MMP-2，并促進Cleaved Caspase-3表達，這可能是下調XIST抑制宮頸癌細胞侵襲遷移和誘導凋亡的機制，miR-186如何調控MMP-9、MMP-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達的具體機制尚不明確，需要進一步探討。

綜上，XIST可能是宮頸癌治療的潛在靶點，下調XIST靶向miR-186作用可抑制宮頸癌細胞侵襲遷移并誘導凋亡，為研究XIST在腫瘤中的調控網絡提供參考。