TGM2對甲狀腺癌干細胞紫杉醇化療敏感性的影響及作用機制①

林 琳 王承芳 洪志軍

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科，大連 116021)

甲狀腺癌發(fā)病率占所有內(nèi)分泌癌90%以上，位居所有癌癥發(fā)病率第5名[1]。Globocan 2018年腫瘤發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球男性和女性甲狀腺癌的發(fā)病率分別為3.1/10萬和10.2/10萬，死亡率分別為0.4/10萬和0.5/10萬[2]。分化型甲狀腺癌是甲狀腺癌的最常見形式，治療手段包括手術(shù)、化學治療、內(nèi)分泌治療、核素內(nèi)放療等傳統(tǒng)治療，預(yù)后相對較好[3，4]。低分化和未分化的甲狀腺癌由于其復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為，傳統(tǒng)治療效果不佳，總中位生存期僅為2～6個月[5]?；熕幬锏哪退幮允菒盒约谞钕侔┲委煹闹饕魬?zhàn)，而導(dǎo)致甲狀腺癌不良預(yù)后的化療抵抗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移均與腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)相關(guān)，CSCs存在于包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞中[6-8]。甲狀腺癌干細胞(thyroid cancer stem cell,TCSC)是存在于甲狀腺細胞中的小部分側(cè)群細胞，具有干細胞的多分化潛能和自我更新能力，導(dǎo)致化療后腫瘤復(fù)發(fā)[9]。因此，闡明TCSC對化療藥物敏感性的作用機制有望改善惡性甲狀腺癌患者預(yù)后。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2,TGM2)是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族成員，其基因編碼組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(tissue transglutaminase type 2,TG2)蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡和細胞外基質(zhì)降解[10]。研究表明TGM2與患者對藥物的低敏感性和低存活率顯著相關(guān)，體外和體內(nèi)實驗已證實TGM2可能是骨肉瘤順鉑化療耐藥性的潛在治療靶點[11]。TGM2在甲狀腺癌中的作用尚未見報道，其與甲狀腺癌細胞的化療藥物耐藥性是否相關(guān)尚未闡明。紫杉醇是各腫瘤治療中廣泛應(yīng)用的化療藥物，可抑制腫瘤細胞的有絲分裂，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[12]。本研究以TCSC為工具細胞，研究TGM2表達影響TCSC對紫杉醇敏感性的作用及機制，尋找TCSC對化療藥物敏感性的潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma公司；堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子均購自美國Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；MTS增殖、Tunnel凋亡染色、細胞凋亡檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；RIPA組織裂解液及PVDF膜均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白濃度檢測BCA液購自美國Thermo公司；TGM2小干擾RNA由上海吉凱基因公司合成；兔抗人TGM2抗體(15100-1-AP)、兔抗人Nanog抗體(14295-1-AP)、兔抗人Sox2抗體(11064-1-AP)、鼠抗人GAPDH抗體(60004-1-Ig)均購自Proteintech公司；鼠抗人caspase-3抗體(ab13585)、鼠抗人Bax抗體(ab182733)均購自abcam公司。

1.1.2組織來源 取我院未分化型甲狀腺癌新鮮組織1例，該患者未接受放化療等任何形式的治療。實驗操作根據(jù)赫爾辛基宣言和我院倫理指南進行，患者知情同意。

1.2方法

1.2.1腫瘤細胞分離和TCSC培養(yǎng) 腫瘤組織無菌條件下去除正常組織和脂肪，用含有抗生素的生理鹽水沖洗。組織剪碎后放入含有1 mg/ml Ⅳ型膠原酶的DMEM-F12培養(yǎng)基中，37℃搖床孵育2 h。用含10% FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基終止消化后，無菌尼龍細胞過濾器過濾，2 000 r/min離心5 min。完全培養(yǎng)基洗1次后，將細胞重懸至含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，2周左右時細胞球開始形成，流式細胞儀分選CD133+的TCSC，無血清培養(yǎng)基中懸浮擴大傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染和qRT-PCR檢測 將呈對數(shù)生長期的TCSC細胞傳代至6 cm培養(yǎng)皿，按說明書將脂質(zhì)體2000與TGM2 siRNA、各組對照轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細胞，分為si-TGM2組和si-NC組，放至培養(yǎng)箱培養(yǎng)。si-TGM2引物序列：5′-GCAGTGACTTTGACG-TCTT-3′，si-NC引物序列5′-GATGAAAGAATTAC-CGAAT-3′。

收集紫杉醇處理72 h及轉(zhuǎn)染TGM2 siRNA 24 h的各組細胞，TRIzol裂解法提取總RNA。設(shè)計合成TGM2引物F:5′-GAGGAGCTGGTCTTAGAGAGG-3′,R:5′-CGGTCACGACACTGAAGGTG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，以cDNA為模板進行qRT-PCR。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，2-ΔΔCt法計算各組實驗數(shù)據(jù)。

1.2.3MTS實驗檢測細胞率 取轉(zhuǎn)染24 h的各組細胞，3 000個/孔、150 μl培養(yǎng)基接種于96孔板，貼壁后分別加入不同濃度紫杉醇 (0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32和64 μmol/L)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照。72 h后30 μl/孔加入MTS試劑，37℃孵育2 h。酶標儀檢測490 nm處OD值，以藥物濃度的Log值為橫坐標，細胞存活率 (OD實驗組-OD空白/OD對照組-OD空白) ×100%為縱坐標，繪制細胞存活曲線，并計算各組細胞IC50值。

1.2.4軟瓊脂克隆形成實驗檢測腫瘤細胞干性 20%無血清培養(yǎng)基與1.2%高壓滅菌的軟瓊脂1∶1充分混勻后，2 ml均勻鋪至6 cm培養(yǎng)皿，4℃冰箱冷卻至固態(tài)作為底層膠。20%無血清培養(yǎng)基與0.6%高壓滅菌的軟瓊脂1∶1充分混勻后作為上層膠，37℃預(yù)熱，并與100 μl 1×105個紫杉醇處理72 h及轉(zhuǎn)染TGM2 siRNA 24 h后的各組細胞充分混勻，鋪至固態(tài)底層膠培養(yǎng)，每隔2 d加入1 ml培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察拍照，2周左右腫瘤球長至較大。

1.2.5Tunnel凋亡染色 將紫杉醇處理48 h的TSCS，以1×106個、150 μl培養(yǎng)基接種于6孔板爬片，分別轉(zhuǎn)染si-NC和si-TGM2 24 h后，PBS洗 2次，1 ml 4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗1次，加入100 μl Tunnel染色液，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次，將爬片放置載玻片上滴加50 μl含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑，倒置熒光顯微鏡觀察細胞熒光。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用無EDTA的胰酶消化紫杉醇處理72 h及轉(zhuǎn)染TGM2 siRNA 24 h后的各組細胞，PBS洗3次，6×105個/管，按照說明書分別加入500 μl Binding Buffer、5 μl 7-ADD、5 μl Annexin V-APC染液，混勻后室溫避光孵育15 min。PBS洗1次，流式細胞儀檢測凋亡細胞百分數(shù)，重復(fù)實驗3次。

1.2.7裸鼠移植瘤模型建立 4周齡雌性裸鼠隨機分為si-NC和si-TGM2組，每組6只。將轉(zhuǎn)染后的各組細胞分別注射于裸鼠右側(cè)腋下，1×107個/只，共100 μl。灌胃給予30 mg/(kg·d)紫杉醇，每4 d 用游標卡尺測量一次腫瘤體積，觀察裸鼠移植瘤大小。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 將紫杉醇處理72 h 及轉(zhuǎn)染TGM2 siRNA 24 h的細胞PBS洗3次，每皿加入100 μl含有1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA，超聲冰上裂解30 min，14 000 r/min、4℃離心30 min。將上清移至新EP管中，測量蛋白濃度，煮沸變性冷卻，行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)方式移至PVDF膜，牛奶室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗室溫孵育2 h，ELC化學發(fā)光法顯示條帶。

2 結(jié)果

2.1TCSC的篩選及鑒定 分選出CD133+的細胞約占全部細胞的1.21%，CD133+細胞中干性相關(guān)基因Nanog、Sox2蛋白表達顯著高于CD133-細胞，TGM2蛋白在CD133+細胞中表達顯著上升(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測CD133-和CD133+細胞中干性相關(guān)基因Nanog、Sox2及TGM2蛋白表達Fig.1 Expression of stem-related genes Nanog,Sox2 and TGM2 proteins in CD133- and CD133+cells were detected by Western blot

表1 CD133-和CD133+細胞干性相關(guān)基因Nanog、Sox2及TGM2蛋白表達

2.2MTS檢測抑制TGM2表達對紫杉醇敏感性的影響 si-TGM2組紫杉醇處理72 h的IC50值為(3.05±0.26)μmol/L，顯著低于si-NC組紫杉醇處理72 h的IC50值(7.97±0.49)μmol/L(P<0.05)，見表2，表明沉默TGM2表達可提高TCSC對紫杉醇的敏感性。

表2 MTS實驗檢測抑制TGM2表達對各組細胞存活率的影響

2.3紫杉醇作用于TCSC對TGM2表達的影響 選擇與si-TGM2組紫杉醇處理72 h的IC50較為接近的濃度(3 μmol/L)的紫杉醇處理TCSC 72 h，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示紫杉醇處理的TCSC中TGM2mRNA的表達為(8.34±0.12)，顯著高于未處理的TCSC中的表達(1.00±0.02) (P<0.05)。

2.4TGM2對紫杉醇處理的TCSC干性的影響 軟瓊脂克隆實驗顯示，si-NC和si-TGM2組腫瘤克隆球形成的數(shù)目分別為(16.67±2.51)個、(7.81±1.42)個，si-TGM2組紫杉醇處理72 h的TCSC腫瘤克隆球形成能力低于si-NC組(P<0.05)，見圖2。

2.5TGM2對紫杉醇處理的TCSC凋亡的影響 Tunnel凋亡染色檢測顯示，與si-NC組相比，si-TGM2組細胞凋亡率明顯提高(P<0.05)，見圖3。流式細胞術(shù)檢測顯示，與si-NC組相比，si-TGM2組細胞凋亡率明顯與提高(P<0.05)，見圖4。

圖3 Tunnel凋亡染色檢測抑制TGM2的表達對紫杉醇處理的TCSC凋亡的影響Fig.3 Tunnel apoptosis staining assay detected effect of inhibition of TGM2 expression on paclitaxel-treated TCSC apoptosis

圖4 流式細胞術(shù)檢測檢測抑制TGM2表達對紫杉醇處理的TCSC凋亡的影響Fig.4 Flow cytometry detected effect of inhibition of TGM2 expression on paclitaxel-treated TCSC apoptosis

2.6TGM2對紫杉醇處理TCSC敏感性的影響 紫杉醇處理后，si-TGM2組裸鼠腫瘤體積顯著小于si-NC組裸鼠腫瘤體積(P<0.05)，見圖5，抑制TGM2表達可提高TCSC細胞在體內(nèi)對紫杉醇的敏感性。

圖5 裸鼠移植瘤實驗檢測TGM2對紫杉醇處理TCSC敏感性Fig.5 Subcutaneous xenograft experiment detected effect of TGM2 on sensitivity of paclitaxel-treated TCSCNote:Compared with si-NC,*.P<0.05.

2.7TGM2對紫杉醇處理的TCSC相關(guān)凋亡蛋白的影響 Western blot檢測顯示結(jié)果顯示，si-TGM2組相關(guān)凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達顯著高于si-NC組細胞(P<0.01)，見圖6、表3。

圖6 Western blot檢測抑制TGM2表達對紫杉醇處理的TCSC相關(guān)凋亡蛋白的影響Fig.6 Western blot detected effect of inhibition of TGM2 on expressions of paclitaxel-treated TCSC-associated apoptotic proteins

表3 各組細胞TGM2及凋亡蛋白caspase-3、Bax表達

3 討論

甲狀腺癌近30年發(fā)病率急劇提高，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是甲狀腺癌相關(guān)死亡的主要原因[13-15]。雖然目前檢測方法和治療手段已提高甲狀腺癌患者生存率，但惡性甲狀腺癌化療藥物耐藥性仍是影響患者預(yù)后的重要因素[9]。多種腫瘤中已證實CSC可促進化療耐藥，miR-33a可有效提高肝癌CSC對多柔比星的敏感性，卵巢癌CSC中抑制survivin表達可提高CSC對紫杉醇的敏感性[16-18]。TCSC具有侵襲性，對常規(guī)療法包括放化療具有高度抗性，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，靶向TCSC可能是侵襲性甲狀腺癌的有效治療策略[19]。因此尋找調(diào)控TCSC的關(guān)鍵基因，對克服CSC耐藥具有重要意義。

TGM2是一種多功能蛋白質(zhì)，以鈣依賴的方式催化蛋白質(zhì)共價交聯(lián)，參與細胞遷移、分化、凋亡和炎癥等過程[20]。研究發(fā)現(xiàn)TGM2可通過調(diào)節(jié)EMT和干性相關(guān)蛋白SOX2影響結(jié)腸癌CSC的轉(zhuǎn)移潛能和干性[21]。Fisher等[22]報道TGM2是鱗狀細胞癌干細胞的干預(yù)靶點，但其調(diào)控TCSC的作用機制尚未明確。TGM2可促進骨肉瘤患者對順鉑耐藥，但TGM2是否調(diào)控TCSC導(dǎo)致紫杉醇耐藥尚未闡明。本研究采用原代培養(yǎng)的方法成功分離TCSC，發(fā)現(xiàn)TGM2蛋白在TCSC中高表達，抑制TCSC中TGM2表達后，其對紫杉醇72 h的IC50值降低，而紫杉醇處理TCSC細胞TGM2表達升高，抑制紫杉醇處理的TCSC TGM2表達后，TCSC軟瓊脂克隆形成能力降低，表明TGM2可促進TCSC對紫杉醇耐藥，但具體作用機制需進一步研究。

研究報道TGM2通過調(diào)節(jié)BCL-2相關(guān)X(Bax)表達及在缺氧條件下釋放細胞色素C抑制骨肉瘤細胞凋亡[23]?；熕幬餁[瘤細胞增強其敏感性的重要作用機制為促進腫瘤細胞凋亡，本研究采用Tunnel凋亡染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示抑制紫杉醇處理的TCSC TGM2表達，細胞凋亡增加，同時裸鼠實驗觀察到抑制TGM2表達，TSCS對紫杉醇的敏感性增強，表明TGM2通過調(diào)控凋亡信號通路影響TCSC對紫杉醇的敏感性。細胞凋亡是一種正常生理過程，其啟動受到嚴格調(diào)控，由多個凋亡信號通路相關(guān)蛋白執(zhí)行，caspase和Bcl-2信號通路是最常見的凋亡途徑。caspase蛋白家族存在細胞質(zhì)，其改變是細胞凋亡的重要標志，caspase-3蛋白是凋亡通路中的效應(yīng)者，通常以無活性前體形式存在，經(jīng)凋亡信號刺激后剪切為具有活性的caspase-3，是不可逆的細胞凋亡標志[24，25]。Bcl-2信號通路是線粒體引發(fā)的凋亡，包括Bcl-2、Bad、Bax等成員，Bax蛋白為凋亡過程通路效應(yīng)者，具有BH結(jié)構(gòu)域。Bax在正常條件下主要分布于細胞質(zhì)，在凋亡信號作用下移至線粒體，并通過BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合線粒體膜上的Bcl-2蛋白，降低Bcl-2的抗凋亡作用。此外Bax可在線粒體膜上形成Bax-Bax同二聚體，改變線粒體膜通透性，釋放細胞色素C促發(fā)細胞凋亡[26]。本研究采用Western blot法檢測紫杉醇處理的TSCS中敲減TGM2表達后caspase-3及Bax蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)紫杉醇處理的si-TGM2組caspase-3及Bax蛋白表達顯著升高，表明TGM2可能通過作用于凋亡蛋白，調(diào)控凋亡信號通路降低TSCS對紫杉醇的敏感性。

綜上所述，TGM2在TCSC中高表達，抑制其表達可提高TCSC對紫杉醇的敏感性，其機制可能是通過作用于凋亡蛋白，調(diào)控凋亡通路。本研究為改善TCSC耐藥提供新的研究策略，TGM2可能成為改善甲狀腺癌患者預(yù)后的潛在靶點。