miR-24-3p靶向MMP-16對鼻咽癌5-8F細胞侵襲、遷移和裸鼠成瘤的影響①

徐 杰 徐 鵬 李夢嬌 任建蘭 劉俊玲 郎錦義

(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤科，瀘州 646000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常見的頭頸部腫瘤，具有明顯區(qū)域性，常見于我國華南地區(qū)[1]。目前我國大部分NPC患者病理類型為低分化型或未分化型非角化性癌，占比95%以上，平均自然生存時間約為18.7個月[2,3]。微小RNA(miRNA)是一類長度約22 bp的內(nèi)源性非編碼RNA，是生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄基因調(diào)控因子，在細胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[4，5]。王路等[6]研究表明，miR-24與NPC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。李吉茜等[7]研究表明其可抑制NPC細胞增殖。本文研究miR-24-3p 靶向作用于MMP-16對NPC 5-8F細胞侵襲、遷移和裸鼠成瘤的影響，闡明其作用機制，為NPC治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞組織標(biāo)本 NPC 5-8F細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。收集NPC患者腫瘤樣本及癌旁組織34例,男18例，女16例，年齡23～67歲，平均年齡(45.13±10.25)歲；體質(zhì)量40～82 kg，平均體質(zhì)量(61.28±8.59)kg，低分化鱗狀細胞癌30例，泡狀核細胞癌患者4例。癌旁組織為用免疫組化ABC法染色距病灶2 cm的組織，光鏡下可見細胞漿或核被染成黃色或棕色，-80℃冰箱備用。

1.1.2實驗動物 SPF級3周齡雄性裸鼠30只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2017-0022，5只/籠，飼養(yǎng)于我院動物中心實驗室。

1.1.3藥物與試劑 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；MMP-16抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；LipofecamineTM2000購自美國ThermoFisher公司； Reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；TRIzol、SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司。

1.1.4儀器 BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機購自德國Leica公司；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；ABI9700 PCR儀購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1建模 參考文獻[8]，裸鼠右前肢皮下接種過表達miR-24 的5-8F細胞，3.5×107個/ml、0.2 ml/只，隔日觀察腫瘤生長情況及小鼠一般情況。

1.2.2細胞培養(yǎng) NPC 5-8F細胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 細胞傳代培養(yǎng)于6孔板，培養(yǎng)24 h后進行細胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將目的基因miR-24-3p轉(zhuǎn)染于5-8F細胞(轉(zhuǎn)染前1 d接種2.5×105個細胞至含2 ml完全培養(yǎng)基的6孔板，鋪板密度為45%左右，siRNA濃度為30 nmol/L，6 h 后棄培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.2.4RT-PCR檢測MMP-16及miR-24-3p表達 TRIzol試劑提取組織樣本及各組細胞總RNA，測定RNA濃度和純度，莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄，Reverse transcriptase Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴增，SYBR PCR Master Mix試劑盒檢測miR-24-3p和MMP-16表達水平。引物均采用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計，由Takara公司合成。MMP-16引物序列：F：5′-CTGAAGCTGATGAAGCAGCC-3′,R：5′-AGTCCAAGAG-AATGGCCGAG-3′,miR-24-3p引物序列：F：5′-TGCTGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGG-3′，R：5′-CCTGTTGTAGTGTTTCCTTTTATGGAG-3′。

1.2.5熒光素酶報告實驗檢測miR-24與MMP-16靶向關(guān)系 擴增包含靶基因與miRNA互補位點的3′UTR序列及mutant序列,上下游引物5′端各含有不同的酶切位點,電泳檢測目的條帶，觀察條帶大小,試劑盒純化PCR產(chǎn)物備用,配制連接反應(yīng)混合液,接種/轉(zhuǎn)染后于96孔板加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，移液槍反復(fù)吸打裂解細胞吸出15 μl,加入至luciferase assay substrate混勻,酶標(biāo)儀500 nm處檢測并記錄數(shù)據(jù)，2次測得數(shù)據(jù)的比值代表各孔樣本的相對熒光強度。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞侵襲情況 將轉(zhuǎn)染后的細胞傳代培養(yǎng)于基質(zhì)膠預(yù)包被的Transwell小室，1×105個/ml，取細胞懸液200 μl加入Transwell小室上室，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，小室下層加入含血清的細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細胞，用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，每孔隨機選取5個視野進行計數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 取對數(shù)期細胞，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管。1 200 r/min 離心10 min后加入裂解液重懸細胞，BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS凝膠電泳緩沖液，100℃變性 10 min，待電泳分離完全后，半干法將蛋白移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各檢測蛋白的特異性一抗(GAPDH 1∶10 000)和(兔抗MMP-16，1∶1 000)，4℃孵育過夜，加二抗(1∶1 000)，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內(nèi)參，顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 實驗前1 d于12孔板背面劃平行的5條直線，消毒滅菌后置于無菌環(huán)境備用。第2天將細胞傳代培養(yǎng)于12孔板，1×105個/ml，轉(zhuǎn)染48 h，10 μl槍頭垂直于培養(yǎng)板背面橫線劃痕。預(yù)冷PBS洗滌3次，每次5 min，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于0 h和24 h于熒光顯微鏡下每孔隨機選取3個視野記錄。

1.2.9免疫組化檢測MMP-16陽性表達 取各組裸鼠腫瘤組織樣本，多聚甲醛固定，制成組織切片，MMP-16免疫組化染色：將組織切片用二甲苯溶液浸泡5 min/次，重復(fù)2次；后梯度乙醇水合，依次在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡5 min；PBS浸洗3次，加入2滴3% H2O2-甲醇溶液，孵育10 min，PBS清洗3次；加入血清封閉20 min，一抗、二抗依次室溫孵育30 min，PBS清洗3次，DAB顯色、復(fù)染、脫水封片，顯微鏡下觀察組織中蛋白表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件和GraphPda Prism5軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，方差分析采用單因素方差分析，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進一步采用SNK方法進行比較；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1miR-24-3p表達情況 與NPC腫瘤樣本相比，癌旁組織miR-24-3p表達顯著升高(P<0.05，圖1A)。與空白對照組相比，陰性對照組miR-24-3p表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對照組相比，目的基因組miR-24-3p表達顯著升高(P<0.05，圖1B)。

圖1 miR-24-3p表達情況Fig.1 Expressions of miR-24-3pNote:Compared with mimic-NC,*.P<0.05.

2.2Transwell檢測細胞侵襲情況 與空白對照組相比，陰性對照組細胞侵襲情況無明顯變化，且單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對照組相比，目的基因組單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 Transwell檢測細胞侵襲情況(×400)

2.3劃痕實驗檢測細胞遷移情況 與空白對照組相比，陰性對照組細胞遷移情況無顯著變化，且24 h細胞劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對照組相比，目的基因組24 h細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 劃痕實驗檢測細胞遷移情況(×400)Fig.3 Cell migration detected by scratch assay(×400)Note:Compared with mimic-NC,*.P<0.05.

2.4miR-24 與MMP-16靶向關(guān)系 miR-24 與MMP-16存在互補位點，見圖4A；NPC腫瘤樣本MMP-16表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見圖4B；與空白對照組相比，陰性對照組MMP-16表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4C；與陰性對照組相比，目的基因組MMP-16表達顯著降低(P<0.05)，見圖4D；與陰性對照組相比，目的基因組MMP-16蛋白表達顯著降低(P<0.05)；miR-24 mimic顯著降低MMP-16野生質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對其突變質(zhì)粒熒光素酶活性無明顯影響，表明miR-24 與MMP-16存在靶向調(diào)控關(guān)系。

圖4 miR-24 與MMP-16靶向關(guān)系檢測情況Fig.4 Detection on targeting relationship between miR-24 and MMP-16Note:Compared with mimic-NC,*.P<0.05.

2.5過表達miR-24對5-8F細胞裸鼠成瘤的影響 與空白對照組相比，目的基因組裸鼠腫瘤組織miR-24-3p表達顯著升高(P<0.05，圖5A)，腫瘤重量顯著降低(P<0.05，圖5B)，MMP-16蛋白表達顯著降低(P<0.05，圖5C)，MMP-16陽性率顯著降低(P<0.05，圖5D)。

圖5 miR-24過表達對5-8F細胞裸鼠成瘤及MMP-16表達的影響Fig.5 Effect of miR-24 overexpression on tumor formation and MMP-16 expression in 5-8F cells in nude miceNote:Compared with Control,*.P<0.05.

3 討論

近年來miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。張?；ǖ萚9]研究表明，基因治療可通過抑制miRNA的翻譯來沉默對應(yīng)的靶基因，從而調(diào)節(jié)其生物學(xué)過程。田翎含等[10]研究表明，miRNA在腫瘤中可能起癌基因或抑癌基因作用。miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中主要通過2種方式發(fā)揮作用，作為抑癌因子抑制原癌基因的激活，或通過下調(diào)腫瘤抑制因子水平或下調(diào)抑癌基因表達引發(fā)癌癥并促進腫瘤生長[11]。汪祖益等[12]研究表明，miRNA在調(diào)控鼻咽癌細胞增殖、 運動、 侵襲、轉(zhuǎn)移及治療敏感性方面發(fā)揮重要作用。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移分為黏附、降解和遷移3個步驟，其轉(zhuǎn)移必須進入血管，在血液中存活，遷移出血管，侵襲外周組織。在腫瘤早期，MMP16介導(dǎo)細胞外基質(zhì)及基底膜降解，為腫瘤增殖創(chuàng)造微環(huán)境。

本研究Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-24-3p高表達的目的基因組細胞侵襲數(shù)目顯著降低，說明miR-24-3p高表達可有效抑制腫瘤細胞侵襲，劃痕實驗發(fā)現(xiàn)miR-24-3p高表達的目的基因組細胞的遷移能力顯著降低，說明miR-24-3p高表達可有效抑制腫瘤細胞遷移，因此miR-24-3p可靶向調(diào)控MMP-16抑制鼻咽癌5-8F細胞的生長、侵襲及遷移。

腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移需要水解腫瘤細胞外基質(zhì)蛋白，穿越基底膜屏障進入循環(huán)系統(tǒng)，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移。基質(zhì)金屬蛋白酶是一種能降解細胞外基質(zhì)預(yù)防腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的金屬離子的蛋白水解酶，比較常見的為Ⅱ型：MMP-2、MMP-9，可降解細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白，抑制腦膠質(zhì)瘤細胞U87的侵襲及轉(zhuǎn)移抑制[13]；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑是特異的內(nèi)生 MMPs 抑制劑[14]。趙聰?shù)萚15]研究表明MMPs抑制劑可直接或間接抑制 MMPs活性，使MMPs含量增加或Timps含量減少，破壞腫瘤細胞屏障從而抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤從原位增殖到侵襲轉(zhuǎn)移，除必須具有降解細胞外基質(zhì)的能力外，還必須具備黏附基質(zhì)生長、遷移的能力。MMPs 是一種能降解細胞外基質(zhì)和血管基底膜的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，在腫瘤細胞突破基底膜屏障而浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[16]。本研究顯示，miR-24-3p高表達的目的基因組鼻咽癌5-8F細胞中MMP-16蛋白表達及陽性率顯著降低且鼻咽癌5-8F細胞侵襲、遷移能力顯著降低，說明miR-24-3p可通過降低MMP-16表達抑制鼻咽癌5-8F細胞的細胞活性及增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為，與Kang等[17]結(jié)論一致。

綜上所述，miR-24-3p可通過靶向MMP-16抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖、侵襲和遷移，同時裸鼠實驗發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可有效抑制腫瘤生長，其作用機制可能與降低MMP-16表達有關(guān)。本研究涉及的蛋白表達較少，且未涉及相關(guān)信號通路，miR-24-3p通過信號通路對裸鼠鼻咽癌的作用機制仍需進一步研究。