丹參酮ⅡA減輕膿毒癥大鼠急性肝腎損傷①

陳智陽 黃江山 徐燕軍 林美英 鄒巧梅 李彩榮

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院思明分院檢驗科,廈門 361003)

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染和重大外科手術(shù)的常見并發(fā)癥，是一種高死亡率的危及生命的疾病[1]。盡管對膿毒癥的病理生理學(xué)了解有了很大的進步，但其治療仍然局限于抗生素、積極的液體復(fù)蘇、血管加壓素給藥和支持治療，患者預(yù)后較差，死亡率較高[2]。因此，探索新的治療方法十分必要。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)是丹參的主要活性成分之一(結(jié)構(gòu)如圖1所示),具有抗氧化、抗菌、抗炎、類激素、神經(jīng)保護等作用，已被用于治療心血管疾病、腫瘤、糖尿病、肝病等[3,4]。已有研究表明丹參酮ⅡA通過抑制高遷移率族蛋白1對膿毒癥小鼠具有保護作用[5]。但丹參酮ⅡA對膿毒癥治療作用尚未完全闡明，本文旨在研究丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠急性肝腎損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 60只雄性SD大鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，雄性，體質(zhì)量(205±20)g，常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

圖1 丹參酮ⅡA化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Tanshinone ⅡA

1.1.2藥物和儀器 丹參酮ⅡA購自美國Sigma-Aldrich(T4952)，純度≥97%。谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(C009-2-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(C010-2-1)購自中國南京建城生物工程研究所；HE染色試劑盒(C0105)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1091)購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗體IL-6(ab100712)、TNF-α(ab208348)、IL-1β(ab100704)ELISA試劑盒購自美國Abcam公司；熒光顯微鏡(DM2700)購自德國徠卡公司；酶標(biāo)儀(FLUOstar Omega)購自德國BMG公司；全自動生化分析儀(LABOSPECT 008 AS)購自日本HITACHI公司。

1.2方法

1.2.1動物模型建立與分組 全部大鼠用10%水合氯醛溶液(350 mg/kg)麻醉，進行中線剖腹手術(shù)，將大鼠隨機分為4組，每組15只：①假手術(shù)組(CTRL)：取出盲腸進行暴露后放回腹腔，縫合切口;②盲腸結(jié)扎穿孔模型組(CLP):取出盲腸后，在盲腸根部約1/3處用4號手術(shù)絲線進行結(jié)扎，再用針輕輕刺破結(jié)扎部位遠(yuǎn)端盲腸2次，2次穿孔相距3 cm 左右，再從穿孔處擠出米粒大小糞便，將盲腸放回腹腔，縫合切口[6]；③利奈唑胺模型組(LNZ)：處理方式同CLP組，處理完畢后腹腔注射25 mg/kg利奈唑胺[7]；④丹參酮 Ⅱ A模型組(TAN):處理方式同CLP組，處理完畢后腹腔注射100 mg/kg丹參酮 Ⅱ A[8]。造模96 h后處死大鼠，采集樣本進行后續(xù)實驗。

1.2.2HE染色 取大鼠肝腎組織用10%福爾馬林溶液固定48 h，石蠟包埋切片，用蘇木精-伊紅進行染色，在熒光顯微鏡下觀測并拍片。

1.2.3TUNEL染色 將肝腎組織石蠟切片脫蠟處理，滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37℃作用20 min，用PBS洗滌3次，加入50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，用PBS洗滌1次，滴加0.2 ml標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min后用PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min后用PBS洗滌3次，最后滴加0.3 ml DAB顯色液后在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.4肝功能指標(biāo) 根據(jù)試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測定大鼠肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活力,在510 nm處測OD值。

1.2.5腎功能指標(biāo) 收集各組大鼠尿液，用全自動生化分析儀測定尿液中蛋白尿含量。采集大鼠血液，分離血清，用全自動生化分析儀檢測肌酐酸、尿素氮水平。

1.2.6ELISA 取各組大鼠血清，用ELISA試劑盒檢測外周血中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.7大鼠存活率 統(tǒng)計大鼠建模后96 h內(nèi)各組大鼠死亡數(shù)，每12 h統(tǒng)計一次，計算大鼠存活率。

2 結(jié)果

2.1肝腎組織病理損傷 HE染色結(jié)果如圖2所示，與CTRL組相比，CLP組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯病理損傷、明顯裂痕、細(xì)胞不完整、出血、炎癥細(xì)胞浸潤等癥狀，說明CLP造成嚴(yán)重肝損傷；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠出血明顯減少，炎癥細(xì)胞減少，細(xì)胞完整性高，且TAN組大鼠肝組織病理損傷減輕度優(yōu)于LNZ組；與CTRL組相比，CLP組大鼠腎小球數(shù)量減少，腎小管水腫、擴張、空泡化、炎癥細(xì)胞浸潤、纖維化、細(xì)胞充血，部分區(qū)域可見蛋白管型，表現(xiàn)出明顯的腎組織病理損傷；與CLP組相比，LNZ組和TAN組大鼠病理損傷程度有所減輕。

圖2 肝腎組織病理損傷(×400)Fig.2 Pathological damage of liver and kidney tissues(×400)

2.2肝腎組織的細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色檢測結(jié)果如圖3所示。與CTRL組相比，CLP組大鼠肝腎細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比較，LNZ、TAN組大鼠肝腎細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

圖3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡Fig.3 TUNEL assays detected cell apoptosisNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.3肝功能指標(biāo) 與CTRL組相比，CLP組大鼠ALT、AST水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠ALT、AST水平顯著降低(P<0.01)，見圖4。

圖4 肝功能指標(biāo)Fig.4 Liver function indexNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.4腎功能指標(biāo) 檢測各組腎功能指標(biāo)血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平，結(jié)果如圖5所示，與CTRL組相比，CLP組大鼠血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平顯著降低(P<0.01)。

圖5 腎功能指標(biāo)Fig.5 Renal function indexNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.5炎癥因子水平 與CTRL組相比，CLP組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與CLP組相比，LNZ、TAN組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01)，見圖6。

圖6 炎癥因子水平Fig.6 Inflammatory factor levelsNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

2.6大鼠存活率 檢測96 h內(nèi)大鼠存活率，結(jié)果如圖7所示，CTRL組大鼠未死亡，與CTRL組相比，CLP組存活率顯著降低(P<0.01)；與CLP組相比較，LNZ、TAN組大鼠存活率顯著升高(P<0.01)。說明丹參酮ⅡA可降低膿毒癥大鼠死亡率。

圖7 大鼠存活率Fig.7 Survival rate of ratsNote:Compared with CTRL group，**.P<0.01；compared with CLP group，##.P<0.01.

3 討論

膿毒癥是一種嚴(yán)重的臨床疾病，死亡率很高，是感染誘發(fā)的全身嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[9]。無論是正常的生理反應(yīng)還是免疫反應(yīng)都可以消滅病原體，而膿毒癥的發(fā)病機制往往為正常反應(yīng)的不相容調(diào)節(jié)[10]。人們普遍認(rèn)為宿主對膿毒癥的反應(yīng)與一系列綜合的、伴隨的、拮抗的過程有關(guān)，包括免疫抑制和過度炎癥[11]。膿毒癥的發(fā)病機制部分是由細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的，細(xì)菌內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞先后釋放早期和晚期促炎細(xì)胞因子[5]。目前缺乏治療膿毒癥的有效藥物，需要研發(fā)新的治療藥物來降低膿毒癥的死亡率[12]。

丹參酮ⅡA是提取自中藥丹參的主要活性成分，為櫻紅色針狀結(jié)晶，在心血管領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13]。丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠心肌具有抗炎、抗氧化、改善凋亡相關(guān)基因和鈣調(diào)神經(jīng)素異常表達(dá)等作用[14]。目前丹參酮ⅡA對膿毒癥的保護作用和具體機制研究較少，本文采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，研究丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠模型肝腎功能的影響。

膿毒癥是急性肝損傷和急性腎損傷最常見的病因之一，而肝腎對機體的重要性不言而喻，因此保證肝腎生理功能的完整性是必要的。有研究表明，丹參酮ⅡA通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用發(fā)揮抗肝損傷作用，促進肝細(xì)胞增殖，說明丹參酮ⅡA對肝可能具有保護作用[15]。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮 ⅡA通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的腎損傷，可將丹參酮 ⅡA作為治療腎損傷的腎保護劑。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA具有減輕膿毒癥大鼠肝腎病理損傷程度和調(diào)節(jié)肝腎功能性指標(biāo)的作用，提示丹參酮ⅡA具有肝腎保護作用。

凋亡是指細(xì)胞的程序性死亡，肝腎細(xì)胞凋亡是造成肝腎損傷和肝腎疾病最基本的中心環(huán)節(jié),在膿毒癥肝腎損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。卜克等[17]研究發(fā)現(xiàn)H2S通過抑制膿毒癥大鼠腎細(xì)胞凋亡改善膿毒癥AKI大鼠腎功能,發(fā)揮腎臟保護作用。馮文明等[18]研究發(fā)現(xiàn)δ阿片受體激動劑通過抑制肝細(xì)胞凋亡對膿毒癥大鼠肝臟起保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA具有抑制膿毒癥大鼠肝腎細(xì)胞凋亡的作用,說明丹參酮ⅡA可能通過抑制細(xì)胞凋亡對膿毒癥大鼠肝腎起保護作用。

膿毒癥的發(fā)病會引發(fā)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征，這說明大量的炎癥因子被釋放到血液中，并到達(dá)多個器官進入血液循環(huán)，導(dǎo)致多個器官損傷[19]。通過抑制及控制炎癥因子的釋放將有助于膿毒癥病情的改善[20]。炎癥反應(yīng)引發(fā)劑TNF-α常應(yīng)用于膿毒癥早期診斷，是膿毒癥早期診斷的重要生物標(biāo)志物。當(dāng)發(fā)生膿毒癥時，大量的TNF-α釋放到血液中并激活巨噬細(xì)胞，使其進一步釋放IL-6和IL-1β等炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)和發(fā)熱反應(yīng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA具有下調(diào)膿毒癥炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA具有減輕膿毒癥大鼠急性肝腎損傷的作用：降低肝腎組織病理損傷程度、抑制肝腎細(xì)胞凋亡、下調(diào)肝功能指標(biāo)ALT、AST水平、下調(diào)腎功能指標(biāo)血清肌酐、尿素氮、蛋白尿水平，下調(diào)炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平、降低膿毒癥大鼠死亡率。本研究尚有不足之處，丹參酮ⅡA劑量單一，具體分子機制尚不明確，故臨床推廣應(yīng)用丹參酮ⅡA治療膿毒癥還需進一步研究。