miR-125b-5p靶向STAT3調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡①

李松濤 岳玉林 王均樂 郁 飛 談 誠 曹 波

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，南京 210008)

血管內(nèi)皮是人體內(nèi)分泌器官，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運、凝血、免疫調(diào)節(jié)、活性物質(zhì)釋放等作用[1]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡是糖尿病血管并發(fā)癥和動脈粥樣硬化等多種疾病的重要原因[2]。miRNA在機(jī)體生理病理過程中扮演重要角色，維持細(xì)胞正常生理功能，與疾病進(jìn)展相關(guān)[3]。miR-125b-5p在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與腫瘤、神經(jīng)損傷等疾病發(fā)生，調(diào)控細(xì)胞生長和凋亡[4，5]。研究顯示，miR-125b-5p可引發(fā)心血管系統(tǒng)疾病，在冠狀動脈狹窄患者中表達(dá)水平低于無狹窄的心臟病患者，且表達(dá)水平越低患者冠狀動脈病變支數(shù)越多[6]。miR-125b-5p在過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中表達(dá)下調(diào)，但其對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響尚不明確[7]。STAT3是機(jī)體中廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞凋亡，促進(jìn)過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]。本研究闡明miR-125b-5p在過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用和靶向調(diào)控機(jī)制，為血管內(nèi)皮損傷相關(guān)疾病的靶向基因治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫；PCNA抗體和C-caspase-3抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；pCDNA3.1-STAT3、pCDNA3.1、miR-125b-5p mimics、mimics control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建；STAT3抗體購自上海酶聯(lián)生物研究所；熒光素酶報告載體由基爾頓生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；p-STAT3抗體購自美國圣克魯斯公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1qPCR測定過氧化氫處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b-5p水平 血管內(nèi)皮細(xì)胞用0、100 μmol/L過氧化氫細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的ECM)培養(yǎng)(每組3個復(fù)孔)，分別記為Control、H2O2組。培養(yǎng)12 h后，qPCR檢測miR-125b-5p表達(dá)。Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用特異性頸環(huán)引物及TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Premix EX Taq進(jìn)行定量PCR檢測，以U6為內(nèi)參，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 20 s；95℃ 10 s；60℃ 20 s，循環(huán)40次。U6引物F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTG-CGT-3′。miR-125b-5p引物F：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTAACT-3′，R：5′-CTCAACTGGTGTGGTGGA-3′。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和上調(diào)效果檢測 血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimics和mimics control(轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000)，100 μmol/L過氧化氫細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為H2O2+miR-125b-5p、H2O2+miR-NC組。H2O2組處理方法同1.2.1。收集培養(yǎng)12 h后的各組細(xì)胞，根據(jù)1.2.1測定miR-125b-5p水平。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞活力 血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板(每組3個復(fù)孔)，培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，加入MTT溶液各10 μl，培養(yǎng)4 h，棄上清，加DMSO溶液150 μl，振蕩5 min，酶標(biāo)儀檢測各孔OD值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按1.2.1和1.2.2分組處理細(xì)胞(每組3個復(fù)孔)，培養(yǎng)12 h后，加入胰蛋白酶消化液收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，懸浮于300 μl Binding Buffer溶液，加入Annexin V-FITC及PI染色液各5 μl，加入200 μl Binding Buffer混勻流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞PCNA和C-caspase-3蛋白表達(dá) 按照1×106個/ml加入蛋白提取試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。蛋白中加入等體積的2×Loading Buffer混合，100℃沸水浴孵育5 min。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。上樣孔加入5 μl預(yù)染marker或30 μg蛋白樣品，在濃縮膠中以90 V電壓電泳，在分離膠中以120 V電壓電泳。NC膜上墊3張濾紙，凝膠平鋪于NC膜，再添加3張濾紙，玻璃棒將氣泡趕盡后，250 mA轉(zhuǎn)膜1 h。將NC膜放于封閉液中，4℃孵育過夜。NC膜放于一抗反應(yīng)液中，室溫結(jié)合2 h，放于二抗孵育液中，室溫結(jié)合2 h。ECL試劑顯色，掃描條帶灰度值，分析PCNA和C-caspase-3蛋白水平，β-actin中間為內(nèi)參。PCNA和C-caspase-3一抗分別以1∶800和1∶600稀釋，二抗以1∶4 000稀釋。

1.2.6miR-125b-5p靶基因預(yù)測和鑒定 Target-scan在線靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-125b-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)STAT3的3′UTR端與miR-125b-5p存在互補(bǔ)結(jié)合位點，構(gòu)建STAT3 3′UTR突變的MUT熒光素酶報告載體及含有STAT3 3′UTR WT熒光素酶報告載體，將MUT和WT分別與miR-125b-5p mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，熒光素酶活性測定試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性變化。收集培養(yǎng)12 h后的H2O2+miR-NC、H2O2+miR-125b-5p組細(xì)胞，按照1.2.5檢測細(xì)胞STAT3、p-STAT3蛋白水平。

1.2.7STAT3過表達(dá)載體對上調(diào)miR-125b-5p的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和凋亡的影響 血管內(nèi)皮細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染陰性對照過表達(dá)載體(pCDNA3.1)、miR-125b-5p mimics及STAT3過表達(dá)載體(pCDNA3.1-STAT3)、miR-125b-5p mimics，100 μmol/L過氧化氫細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為H2O2+miR-125b-5p+Vector、H2O2+miR-125b-5p+STAT3(每組3個復(fù)孔)，按照1.2.3、1.2.4及1.2.5檢測細(xì)胞活力、凋亡和PCNA、C-caspase-3、STAT3、p-STAT3蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1過氧化氫誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)下調(diào) 血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過氧化氫處理后，細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)Fig.1 Expression of miR-125b-5p in vascular endothelial cells under hydrogen peroxideNote:Compared with Control,*.P<0.05.

2.2miR-125b-5p mimics提高過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimics后血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過氧化氫處理后，細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)水平升高，見圖2。

圖2 miR-125b-5p mimics轉(zhuǎn)染后對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b-5p表達(dá)的影響Fig.2 Effects of miR-125b-5p mimics transfection on expression of miR-125b-5p in vascular endothelial cells under hydrogen peroxideNote:Compared with H2O2+miR-NC,*.P<0.05.

2.3上調(diào)miR-125b-5p對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和凋亡的影響 過氧化氫處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞OD值降低，細(xì)胞凋亡率升高，PCNA蛋白水平降低，C-caspase-3蛋白水平升高；而miR-125b-5p mimics可提高過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞OD值，降低細(xì)胞凋亡率，提高PCNA蛋白表達(dá)水平，降低C-caspase-3蛋白水平，見圖3。說明上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)可提高過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力并減少細(xì)胞凋亡。

圖3 上調(diào)miR-125b-5p對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-125b-5p up-gregulating on prolifera-tion and apoptosis of vascular endothelial cells under hydrogen peroxide conditionsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with H2O2+miR-NC,#.P<0.05.

2.4miR-125b-5p靶向調(diào)控STAT3 靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p與STAT3的3′UTR端存在互補(bǔ)結(jié)合位點，熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)STAT3為miR-125b-5p的靶基因，見圖4。

圖4 miR-125b-5p靶基因預(yù)測和鑒定Fig.4 miR-125b-5p up-regulating targeting gene prediction and identificationNote:Compared with miR-NC,*.P<0.05.

2.5上調(diào)miR-125b-5p可降低過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)水平 上調(diào)miR-125b-5p的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過氧化氫處理后，細(xì)胞STAT3、p-STAT3蛋白水平下降，見圖5。

圖5 上調(diào)miR-125b-5p對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-125b-5p up-regulation on STAT3 and p-STAT3 protein expressions in vascular endothelial cells under hydrogen peroxide conditionsNote:Compared with H2O2+miR-NC,*.P<0.05.

2.6STAT3過表達(dá)載體和miR-125b-5p mimics共轉(zhuǎn)染對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力、凋亡和p-STAT3、STAT3、PCNA、C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與共轉(zhuǎn)染陰性對照過表達(dá)載體和miR-125b-5p mimics的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染STAT3過表達(dá)載體和miR-125b-5p mimics的血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過氧化氫處理后，細(xì)胞OD值降低，凋亡率升高，p-STAT3、STAT3、C-caspase-3蛋白水平升高，PCNA蛋白水平降低，見圖6。說明STAT3過表達(dá)載體可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-125b-5p對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力和凋亡作用。

圖6 STAT3過表達(dá)載體和miR-125b-5p mimics共轉(zhuǎn)染對過氧化氫條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力、凋亡和p-STAT3、STAT3、PCNA、C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of STAT3 overexpression vector and miR-125b-5p mimics co-transfection on proliferation,apoptosis and expressions of p-STAT3,STAT3,PCNA and C-caspase-3 proteins in vascular endothelial cells under hydrogen peroxide conditions Note:Compared with H2O2+miR-125b-5p+Vector,*.P<0.05.

3 討論

氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致血管內(nèi)皮組織受損，影響血管內(nèi)皮功能，過氧化氫是構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的誘導(dǎo)因子[9]。本研究顯示，過氧化氫處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，說明過氧化氫可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，提示造模成功。

miRNA參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[10]。miR-125b-5p與心血管系統(tǒng)疾病有關(guān)，心臟病動脈狹窄病變支數(shù)越多，miR-125b-5p表達(dá)水平越低，其在氧化應(yīng)激條件下的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[6,7]。本研究結(jié)果顯示，miR-125b-5p在過氧化氫刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-125b-5p可減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力和PCNA蛋白水平，降低C-caspase-3蛋白表達(dá)。PCNA是細(xì)胞活力標(biāo)志蛋白，其表達(dá)水平高低提示細(xì)胞活力[11]。C-caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子，指標(biāo)細(xì)胞凋亡[12]。上調(diào)miR-125b-5p表達(dá)可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，證實miR-125b-5p在氧化應(yīng)激條件下抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，miR-125b-5p可能是血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)因子。

STAT3是與細(xì)胞生長、分化、凋亡等密切相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，被磷酸化后形成p-STAT3發(fā)揮信號傳遞作用[13]。STAT3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷，抑制STAT3信號通路可改善動脈粥樣硬化患者血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，STAT3信號抑制劑可緩解氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p靶向調(diào)控STAT3表達(dá)，上調(diào)miR-125b-5p可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞STAT3表達(dá)水平，而上調(diào)STAT3表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-125b-5p對氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，提示miR-125b-5p靶向調(diào)控STAT3表達(dá)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-125b-5p保護(hù)免疫血管內(nèi)皮，靶向作用于STAT3抑制過氧化氫誘導(dǎo)的血管細(xì)胞凋亡，但調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探討。本研究為闡明miR-125b-5p在血管內(nèi)皮損傷中的作用機(jī)制及其靶向基因治療提供參考。