miR-138靶向OX40L對實驗性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠的作用機制研究①

趙秀英 符之富 符彬莎 李文華

(海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院，?？?570311)

自身免疫性腦炎是兒童較常見的腦部疾病。這種腦炎由多種免疫介導(dǎo)，主要癥狀包括精神障礙、行為異常、記憶衰退、癲癇等癥狀，嚴(yán)重影響兒童健康，通常需要多學(xué)科聯(lián)合治療[1]。研究顯示，T細(xì)胞對全身免疫穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[2]，然而經(jīng)過十多年的研究，對自身免疫應(yīng)答過程中T細(xì)胞的分子應(yīng)答機制尚未完全明確。有研究顯示，microRNA(miRNA)是生物體內(nèi)的關(guān)鍵基因，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)行為，這說明miRNA對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[3,4]。研究顯示，miR-138在大腦中富集，可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，如小鼠海馬神經(jīng)元中樹突棘的形態(tài)發(fā)生；也有研究表明miR-138在癌癥中具有多方面的作用，但miR-138與免疫系統(tǒng)間的互作機制尚不清楚[5-8]。因此，本研究將通過構(gòu)建實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型，獲取自身免疫性腦炎中的關(guān)鍵細(xì)胞，在細(xì)胞水平探究miR-138對T細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康SPF級C57BL/6小鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量15～18 g，5周齡，雌雄各半。

1.1.2主要試劑 MOG35-55多肽購于上海翱博生物公司；含卡介苗弗氏完全免疫佐劑(FCA)購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；百日咳結(jié)核桿菌毒素PTX購于美國Sigma公司；percoll分離液、FACS緩沖液購于上海穎心實驗室設(shè)備有限公司；小鼠FC Block抗體、CD45-PE抗體、TLR3抗體、TLR4抗體及FIZZ-1抗體購于北京百奧萊博科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒購于美國Invitrogen公司；PrimeScript miRNA cDNA試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；TRIzol試劑盒、CD4+T細(xì)胞陰性分選免疫磁珠試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒及定點誘變試劑盒購于北京賽因坦科技有限公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建EAE小鼠模型 取40只C57BL/6小鼠，隨機挑選15只作為對照組，其余25只用于構(gòu)建EAE小鼠模型。將人工合成的MOG35-55多肽(200 μg)溶解于200 μl PBS緩沖液，與200 μl含4 mg/ml卡介苗的FCA在真空中完全混勻，30 min后制備完成。同時，將200 μl PBS緩沖液與等量FCA溶液乳化，用于對照組小鼠。將上述制備好的2種混合乳液在第0天分別注射于小鼠雙側(cè)背部脊椎旁分4點皮下，在各組小鼠免疫后的第0天和第2天腹腔注射200 ng PTX，至此EAE小鼠模型構(gòu)建完成。

1.2.2EAE小鼠模型神經(jīng)功能評分 本研究中EAE小鼠模型的神經(jīng)功能評分按照6分法進行，具體評分規(guī)則如下：0分：無明顯疾病癥狀；0.5分：尾巴部分無力，出現(xiàn)拖尾癥狀；1.0分：尾巴完全癱瘓，尾巴變軟，完全無力；2.0分：雙后肢無力；2.5分：后肢部分癱瘓，單后肢完全癱瘓；3.0分：雙后肢完全癱瘓，被動翻身后不能自行恢復(fù)；3.5分：雙后肢完全癱瘓，前置部分癱瘓；4.0分：四肢完全癱瘓；5.0分：瀕死狀態(tài)；6.0分：死亡。

1.2.3分離活化小膠質(zhì)細(xì)胞 取處于發(fā)病高峰期的EAE組小鼠及同時期的對照組小鼠各5只，將小鼠窒息處死后在無菌條件下獲取各組小鼠的腦組織及脊髓。在室溫條件下將腦組織與脊髓置于含0.25%胰酶及1 mmol/L的EDTA混合液中消化，15 min 后用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基終止消化。消化后的細(xì)胞800 g離心10 min，收集離心后的細(xì)胞沉淀并使用percoll分離液分離，900 g離心 7 min 后再次收集細(xì)胞沉淀。收集的細(xì)胞沉淀置于400 μl的FACS緩沖液中重懸，加入FC Block冰浴 30 min 后800 g離心5 min，再次以50 μl的FACS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml后加入抗CD11b-FITC及抗CD45-PE流式抗體，避光冰浴30 min 后800 g離心5 min棄上清，用FACS緩沖液重懸后使用流式細(xì)胞儀分選小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.4免疫熒光染色 取處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以1.5×105個/孔的密度接種于帶有滅菌蓋玻片的6孔板中，接種后于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。去除蓋玻片后按照二步雙染色法處理，在熒光顯微鏡下觀察TLR3、TLR4及FIZZ-1的表達。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種至含RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育72 h，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將合成的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞內(nèi)，12 h后將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含完全培養(yǎng)基的6孔板中保存以用于后續(xù)實驗。

1.2.6RT-qPCR實驗 使用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞內(nèi)的總RNA，使用PrimeScript miRNA cDNA試劑盒合成cDNA，使用Step OnePlusTM實時PCR系統(tǒng)進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 20 s，60℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。U6及GAPDH分別作為miR-138和OX40L mRNA的內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算miR-138及OX40L mRNA的相對表達水平。引物序列如下：miR-138(F：5′-GTATTGACTAGATTAATCACTGT-3′；R：5′-TCTCCGCATCACCACAGAA-G-3′)，OX40L mRNA(F：5′-CCTACATCTGCCTGC-ACTTCTC-3′；R：5′-TGATGACTGAGTTGTTCTGCA-CC-3′)，U6(F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，GAPDH(F：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；R:5′-ACCACCC-TGTTGCTGTAGCCAA-3′)。

1.2.7CD4+T細(xì)胞的分離 取對照組小鼠5只，在無菌條件下取其外周血，按照小鼠CD4+T細(xì)胞陰性分選免疫磁珠試劑盒說明書分離CD4+T細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測獲取的CD4+T細(xì)胞純度。

1.2.8CD4+T細(xì)胞增殖活性檢測 取處于對數(shù)生長期的CD4+T細(xì)胞及活化小膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中間接共培養(yǎng)96 h，每間隔24 h使用MTT比色法檢測CD4+T細(xì)胞的增殖活性。

1.2.9細(xì)胞凋亡檢測 自CD4+T細(xì)胞及活化小膠質(zhì)細(xì)胞間接共培養(yǎng)后，每24 h收集懸浮的T細(xì)胞，按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書檢測T細(xì)胞的凋亡水平。

1.2.10Western blot 在各組細(xì)胞按照1.2.5中的方法轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解緩沖液提取小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠中分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的緩沖液封閉2 h后在蛋白質(zhì)樣品中加入鼠抗人OX40L抗體(1∶1 000)或GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)在4℃條件下孵育過夜。加入相應(yīng)的山羊抗兔二抗(1∶2 000)后在室溫下孵育1 h，使用ECL試劑盒顯影后拍照分析。

1.2.11雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用定點誘變試劑盒誘變產(chǎn)生OX40L-MUT，并將其與OX40L-WT克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報告載體中。使用Lipofectamine 2000試劑盒將pMIR-OX40L-WT、pMIR-OX40L-MUT、miR-NC及miR-138 mimics共轉(zhuǎn)染至小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，在37℃、5%CO2的條件下將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析相對熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，t檢驗用于分析兩組間差異，單因素方差分析用于比較多組間差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EAE模型的鑒定 將40只小鼠隨機分為對照組(15只)和EAE組(25只)。EAE組小鼠自免疫后的5 d后開始發(fā)病，大部分表現(xiàn)為尾部無力，后肢無力等癥狀。在16 d左右進入發(fā)病高峰期，小鼠均出現(xiàn)四肢癱瘓甚至大小便失禁等癥狀。在25 d左右時進入緩解期，在此期間內(nèi)EAE組小鼠體重逐漸增加，癥狀有不同程度的緩解。對照組小鼠在此期間內(nèi)體重增加正常，未出現(xiàn)不良癥狀。EAE組與對照組小鼠體重及神經(jīng)功能評分變化如圖1，小鼠發(fā)病情況見表1。

圖1 EAE小鼠模型鑒定Fig.1 Identification of EAE mouse modelNote:A.Changes in body weight of mice；B.Changes of neurological function scores in mice.

表1 小鼠發(fā)病情況對照表

2.2小膠質(zhì)細(xì)胞的分選與鑒定 經(jīng)抗體標(biāo)記處理后的單核細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀分選，結(jié)果顯示EAE組小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化比例為21%，對照組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化比例為11%，符合預(yù)期結(jié)果，見圖2A。免疫熒光實驗結(jié)果顯示，EAE組活化小膠質(zhì)細(xì)胞TLR3、TLR4及活化小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物FIZZ-1的表達相較于對照組顯著增加，見圖2B。

圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞的分選與鑒定Fig.2 Sorting and identification of microgliaNote:A.Flow cytometry sorting microglial chart；B.TLR3,TLR4 and FIZZ-1 immunofluorescence staining results.

2.3活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138的表達水平 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-138在EAE組小鼠模型腦組織中的表達水平顯著下調(diào)(P<0.05，圖3A)，同時，在分離的EAE組小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138的表達水平也顯著下調(diào)(P<0.05，圖3B)，因此后續(xù)實驗選擇EAE組小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞(簡稱活化小膠質(zhì)細(xì)胞)進行。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138表達水平較轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞顯著上升(P<0.05，圖3C)。將轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-138 mimics的活化小膠質(zhì)細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，以MTT比色法檢測T細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics的活化小膠質(zhì)細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)會顯著抑制T細(xì)胞的增殖(P<0.05，圖3D)。凋亡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics的活化小膠質(zhì)細(xì)胞會顯著促進T細(xì)胞的凋亡(P<0.01，圖3E)。

圖3 miR-138在活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)低表達Fig.3 Low expression of miR-138 in activated microgliaNote:A.miR-138 expression in mouse brain tissue；B.miR-138 expression in microglia；C.Transfection efficiency test；D.MTT colorimetric method to detect T cell proliferation；E.Flow cytometry to detect T cell apoptosis.#.P<0.05 vs Control group；*.P<0.05，**.P<0.01 vs miR-NC group.

2.4OX40L是miR-138的下游靶基因 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，OX40L蛋白是miR-138的下游靶基因，結(jié)合位點見圖4A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，OX40L-WT組中轉(zhuǎn)染miR-138 mimics的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，且OX40L-MUT組中轉(zhuǎn)染miR-138 mimics對熒光素酶活性基本無影響(圖4B)。此外，Western blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics后會顯著抑制活化小膠質(zhì)細(xì)胞OX40L的表達(P<0.01)，RT-qPCR檢測也顯示過表達miR-138會抑制活化小膠質(zhì)細(xì)胞OX40L mRNA的表達(P<0.001，圖4C、D)。

圖4 OX40L為miR-138的下游靶基因Fig.4 OX40L is downstream target gene of miR-138Note:A.Binding site of miR-138 and OX40L；B.Dual luciferase reporter gene test；C.Western blot detection of OX40L protein expression；D.RT-qPCR detection of OX40L mRNA protein expression.**.P<0.01,***.P<0.001 vs miR-NC group.

2.5小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138/OX40L分子軸調(diào)控T細(xì)胞的增殖與凋亡 RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics會顯著上調(diào)其在活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(P<0.01，圖5A)。轉(zhuǎn)染si-OX40L或pc-OX40L會顯著下調(diào)或上調(diào)OX40L mRNA在活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(P<0.01)，Western blot實驗結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，且同時過表達miR-138和OX40L并未對活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)OX40L的表達量產(chǎn)生顯著影響，圖5B、C。MTT檢測結(jié)果顯示，敲低活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)OX40L的表達會顯著抑制T細(xì)胞的增殖(P<0.05)，相反，過表達OX40L會顯著促進T細(xì)胞的增殖(P<0.05)，但同時過表達活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138和OX40L并未對T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著影響(P<0.05，圖5D)。凋亡結(jié)果顯示，敲低活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)OX40L的表達會促進T細(xì)胞凋亡(P<0.001)，過表達OX40L則會抑制T細(xì)胞凋亡(P<0.001)，同時過表達活化小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138和OX40L并未對T細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響(圖5E)。

圖5 小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138/OX40L分子軸對T細(xì)胞的增殖與凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-138/OX40L molecular axis in microglia on proliferation and apoptosis of T cellsNote:A，B.Transfection efficiency test；C.MTT colorimetric method to detect T cell proliferation；D.Western blot detection of OX40L protein expression；E.Flow cytometry to detect T cell apoptosis.##.P<0.01 vs miR-NC group；*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 vs Control group.

3 討論

兒童自身免疫性腦炎系自身免疫性反應(yīng)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，是由于神經(jīng)元蛋白影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞及興奮性的自身免疫性抗體所致。臨床中以抗N-甲基-D-天門冬氨酸受體腦炎和自身免疫性邊緣葉腦炎最為常見，其中抗N-甲基-D-天門冬氨酸受體腦炎約占所有病例的80%以上[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有免疫活性的細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境變化檢測最敏感的指標(biāo)之一[10]。在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞一直處于靜止?fàn)顟B(tài)，持續(xù)監(jiān)測周圍環(huán)境變化。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到外界刺激后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會分泌一些重要的免疫因子，在疾病中發(fā)揮重要作用。研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)生在自身免疫性腦炎的發(fā)病早期[11]，且小鼠的自身免疫性腦炎通過T細(xì)胞誘導(dǎo)，結(jié)合二者在時間與空間上的聯(lián)系，筆者推測小膠質(zhì)細(xì)胞與T細(xì)胞之間存在一定的互作。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，可以與mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后影響靶基因的翻譯與表達。miR-138是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，Ren等[12]研究顯示，miR-138通過MLK3/JNK/MAPK信號通路抑制小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-138在EAE組小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的水平顯著下調(diào)，且過表達小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-138的表達會顯著影響T細(xì)胞的增殖活性和凋亡水平，結(jié)果表明miR-138在自身免疫性腦炎的過程中發(fā)揮重要作用，且證實了筆者的前期推測。免疫共刺激分子OX40及其配體(OX40 ligand，OX40L)與T細(xì)胞的凋亡、增殖、細(xì)胞因子的表達密切相關(guān)[13]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，OX40L在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達水平對維持T細(xì)胞的增殖及多種因子的分泌提供了分子基礎(chǔ)。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，OX40L與miR-138在3′非翻譯區(qū)有部分互補結(jié)合序列，并通過實驗證實OX40L是miR-138的下游靶基因。此外，過表達OX40L在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達會顯著促進T細(xì)胞的增殖并抑制凋亡，這與Wang等[14]研究結(jié)果一致。同時過表達OX40L與miR-138在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達對T細(xì)胞的增殖與凋亡并未產(chǎn)生顯著影響。

通過上述研究發(fā)現(xiàn)，EAE會導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化并下調(diào)miR-138表達，同時通過miR-138/OX40L分子軸上調(diào)OX40L在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達，進而影響T細(xì)胞的增殖和凋亡，可能對EAE的治療產(chǎn)生一定效果。