CXXC5對心房顫動大鼠心肌纖維化的影響及機制①

李小兵 王 軍 呂 瑛 黃建成 李紅英 李志杰 蘇振宇

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院心臟外科,石家莊 050031)

心房顫動是潛在的心臟疾病，是常見的持續(xù)性快速型心律失常，患病率和死亡率均較高，男性的發(fā)病率高于女性，且隨著年齡的增長，心房顫動的患病率升高，隨著人口老齡化，心房顫動對人類健康造成嚴重威脅，心肌纖維化在心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中具有重要作用，是心房顫動發(fā)生的重要原因之一[1,2]。TGF-β是組織修復(fù)和纖維化發(fā)生的主要因素，TGF-β1可誘發(fā)心肌纖維化，Smads家族蛋白是TGF-β信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵傳導(dǎo)分子，TGF-β1/Smad信號通路是其最重要的傳導(dǎo)通路[3,4]。CXXC5具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞能量代謝、細胞凋亡、血管生成等生物學功能，在多種疾病發(fā)病中的作用越來越受到重視，在惡性腫瘤中作為一種潛在的腫瘤抑制因子，參與皮膚損傷后皮膚纖維化的形成，但其在心肌纖維化中的作用尚不清楚[5,6]。本文對CXXC5在心房顫動心肌纖維化中的表達及作用機制進行研究，探討其在心房顫動心肌纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡、雄性、清潔級、體質(zhì)量210～220 g SD大鼠70只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.1.2主要試劑 ISO、蘇木素、伊紅(美國Sigma公司)，BCA試劑盒、β-actin抗體、Ⅰ型膠原單克隆抗體、CXXC5單克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體、Smad7單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體等(美國BT公司)，Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7(上海生物工程技術(shù)有限公司引物設(shè)計與合成)，CXXC5過表達質(zhì)粒腺病毒載體和陰性對照質(zhì)粒腺病毒載體(天津賽爾生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及建立心房顫動模型 將40只大鼠分為對照組、空白對照組、陰性對照組和過表達CXXC5組，每組10只?？瞻讓φ战M、陰性對照組和過表達CXXC5組大鼠建立心房顫動心肌纖維化模型：大鼠腹部皮下注射ISO(5 mg/kg，1次/d，共14 d)，對照組腹部皮下注射等量生理鹽水；用藥后采用生物信號采集處理系統(tǒng)(MedLab-U/4C501H)描記大鼠心電圖，記錄標準Ⅱ?qū)?lián)。對照組為標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，建模大鼠出現(xiàn)標準Ⅱ?qū)?lián)心房顫動心電圖(見圖1)，表示心房顫動模型建立成功(標準Ⅱ?qū)?lián)心房顫動心電圖：①P波消失、代之以大小不等，形態(tài)各異的小F波，小F波的頻率350～600次/min；②心室率極其不規(guī)則，心室率100～160次/min；③QRS波群的形態(tài)正常，當心室率較快時，QRS波群可以增寬變形)。Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平測定 取100 g心肌組織在冰上勻漿器中剪碎，加入Trizol研磨混勻后提取心肌組織總RNA，采用熒光定量PCR(qPCR)測定各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原。

1.2.2處理 造模后第2天，過表達CXXC5組大鼠經(jīng)尾靜脈注射過表達CXXC5病毒5×109PFU，陰性對照組經(jīng)尾靜脈注射等量陰性對照病毒，對照組和空白對照組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。注射后第7天處死大鼠，取心臟組織備用。

1.2.3HE染色 將石蠟包埋心肌組織切成5 μm切片，烤片30 min，脫蠟水化，蘇木素染色1 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水沖洗，氨水返藍30 s，蒸餾水沖洗，伊紅染色20 s，酒精脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.4Masson染色 將石蠟標本切片烤片 30 min，脫蠟水化，蒸餾水沖洗，蘇木精染色10 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水沖洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色10 min，蒸餾水沖洗，磷鉬酸溶液染色，甲苯胺藍染色10 min，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5膠原容積分數(shù)(CVF)測定 Masson染色后膠原纖維被染成紫藍色，纖維素和心肌細胞被染成紫紅色，應(yīng)用IBAS Ⅱ圖像軟件分析系統(tǒng)，測定CVF，CVF=膠原面積/總面積。

圖1 兩組大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖Fig.1 Ⅱ lead ECG of rat in two groups

1.2.6大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平測定 取100 g心肌組織在冰上勻漿器中剪碎，加入Trizol研磨混勻后提取心肌組織總RNA，采用熒光定量PCR(qPCR)測定各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原(上游引物：5′-GATCTGTATCTGCCACAATG-3′，下游引物：5′-CAGAAAGCACAGCACTCGCC-3′)、CXXC5(上游引物：5′-GTGGACGGCTCGCGCAGTTG-3′，下游引物：5′-CACACGACCACTGACATTGC-3′)、TGF-β1(上游引物：5′-TGGCGTTAGCTTCGTAAGG-3′，5′-GTGTTGACCG-TTTGCAG-3′)、Smad7(上游引物：5′-AGGCTGTACTGTATCCAAGA-3′，下游引物：5′-GAATTAATGAA-GATAGGGTA-3′) mRNA水平，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 20 s、62℃ 30 s、72℃ 15 s，共40個循環(huán)；72℃ 5 min。以U6(上游引物：5′-CTCGCTTGGCCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTGAGGAATTTGCGT-3′)為內(nèi)參，大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.7心肌組織中 Ⅰ 型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平測定 將各組大鼠心肌組織放入EP管中、加入蛋白裂解液裂解，13 000 r/min離心15 min后取上清，采用BCA法測定心肌組織蛋白濃度，采用Western blot法測定大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗( Ⅰ 型膠原單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、CXXC5單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、TGF-β1單克隆抗體稀釋比例1∶1 000、Smad7單克隆抗體稀釋比例1∶500)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)孵育1 h,ECL顯影。目標蛋白的相對表達量=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌HE染色 HE染色顯示心肌細胞被染成紫紅色，心肌細胞核被染成紫藍色。對照組大鼠心肌細胞橫紋清晰、細胞排列整齊，細胞大小正常；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌細胞顯著增大、排列紊亂，間質(zhì)增多，有明顯成纖維細胞增生；過表達CXXC5組大鼠心肌細胞排列稍紊亂，間質(zhì)稍增多，有少量成纖維細胞增生，見圖2(圖中箭頭所示為成纖維細胞)。

2.2心房顫動心肌纖維化大鼠心肌Masson染色 Masson染色顯示心肌間質(zhì)膠原纖維呈紫藍色，心肌細胞呈紫紅色，細胞核呈黑色。對照組心肌細胞排列整齊、膠原纖維含量少，細胞大小正常；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌細胞排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維增多，心肌纖維化嚴重；過表達CXXC5組心肌細胞排列稍紊亂，有少量膠原沉積。與對照組相比，其他三組大鼠CVF升高(P<0.05)，與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠CVF降低(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組大鼠CVF差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表1(圖中箭頭所示為膠原沉積)。

2.3過表達CXXC5對心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中 Ⅰ 型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平的影響 與對照組相比，其他3組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7 mRNA水平降低(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平升高(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7 mRNA水平升高(P<0.05)，TGF-β1 mRNA水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌組織中CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色(×200)Fig.2 HE staining of myocardial tissue in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色(×200)Fig.3 Masson staining of myocardial tissues of rats in each group(×200)Note:A.Control group；B.Blank control group；C.Negative control group；D.Over-expressed CXXC5 group.

表1 各組大鼠CVF比較

圖4 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7 mRNA水平Fig.4 Type Ⅰ collagen,CXXC5,TGF-β1 and Smad7 mRNA levels in each groups of rat myocardial tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with blank control group,#.P<0.05；compared with negative control group,△.P<0.05.

2.4過表達CXXC5對心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、 Smad7蛋白水平的影響 與對照組相比，其他3組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7蛋白水平升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平降低(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，過表達CXXC5組大鼠心肌組織中CXXC5、Smad7蛋白水平降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白水平升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組大鼠心肌組織中CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖5。

表2 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白水平比較

圖5 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、CXXC5、TGF-β1、Smad7蛋白表達Fig.5 Western blot analysis of type I collagen，CXXC5,TGF-β1 and Smad7 proteins in each group of rat myocardial tissueNote:1,2.Control group；3,4.Blank control group；5,6.Negative control group；7,8.Over-expressed CXXC5 group.

3 討論

心房顫動的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前認為心房顫動是心房重構(gòu)、異常鈣離子電流、自主神經(jīng)系統(tǒng)改變共同作用的結(jié)果，其中心房重構(gòu)是心房顫動的重要環(huán)節(jié)[7]；心房重構(gòu)包括心房電重構(gòu)和心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，心房電重構(gòu)是由于縫隙連接蛋白功能及數(shù)量和心房肌離子通道的改變所引起，心房電重構(gòu)可引起心房肌有效不應(yīng)期縮短、不應(yīng)期離散度增加、傳遞受損、觸發(fā)活動增多、傳導(dǎo)各向異性增加，有利于局部多子波和微折返的形成[8]；心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的顯著特征為心房纖維化，正常心肌細胞被膠原纖維化包繞劃分，從而破壞心肌細胞之間的傳導(dǎo)連續(xù)性，引起傳導(dǎo)異質(zhì)性增加、傳導(dǎo)速度減慢，為折返環(huán)的形成和單項傳導(dǎo)阻滯提供了病理基礎(chǔ)[9]。心房顫動還可導(dǎo)致心房擴大、心房收縮力下降，有利于心房顫動的維持發(fā)展。臨床上抗心律失常藥主要針對心房電重構(gòu)，因此治療效果有限；心房纖維化作為心房顫動最危險的因素，探討其發(fā)病機制對阻斷心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)具有重要意義，可為心房顫動的預(yù)防和治療提供新的思路。

TGF-β為一種多功能細胞因子，在纖維化發(fā)生中具有重要作用，是關(guān)鍵的促進纖維化因子，對沉積細胞外基質(zhì)具有強烈的促進作用[10]；TGF-β1是TGF-β的亞型之一，可促進心肌細胞中Ⅰ型膠原纖維蛋白的合成和分泌，從而誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生[11]。Smads蛋白家族是TGF-β信號傳導(dǎo)的介導(dǎo)子，TGF-β1發(fā)揮生物學作用的主要通路為TGF-β1/Smad信號通路，Smad7是該信號通路的抑制性蛋白，可以和Smad2和Smad3競爭性結(jié)合，阻止Smad2和Smad3磷酸化激活，從而對TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮抑制作用[12]；降低心肌組織中Smad7表達可促進心肌纖維化，Smad7過表達可促進心肌纖維化[13]。

CXXC5為一種新發(fā)現(xiàn)的具有CXXC型鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，唯一人類5q31染色體上，在心臟、肝臟、肺臟、前列腺、卵巢、粒細胞等不同組織和細胞中具有不同水平的表達，主要定位在細胞質(zhì)和細胞核中[14,15]。CXXC5具有廣泛的生物學功能，在成纖維細胞、成骨細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、神經(jīng)干細胞、粒細胞等細胞的遷移和分化中發(fā)揮重要作用[16,17]；在細胞能量代謝、血管生成、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也具有重要作用[18,19]。CXXC5在多種疾病中的作用越來越受到關(guān)注，目前研究比較多的為惡性腫瘤，CXXC5在惡性腫瘤中作為一種潛在的腫瘤抑制因子[20]。CXXC5也參與纖維化的過程，在皮膚損傷修復(fù)過程中，CXXC5參與皮膚纖維化的形成，過表達CXXC5可降低α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白Ⅰ等的水平，敲低CXXC5可使皮膚傷口膠原合成增加，促進傷口愈合。

CXXC5在心肌纖維化中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中CXXC5水平降低，考慮CXXC5可能參與心房顫動心肌纖維化的過程；且心房顫動心肌纖維化心肌組織中Smad7水平降低，Ⅰ型膠原、TGF-β1水平升高。Ⅰ型膠原在心房纖維化時合成和分泌增加，Ⅰ型膠原含量可反映心房纖維化程度。因此由本研究結(jié)果分析心房顫動的纖維化和心房重構(gòu)與TGF-β1/Smad7抑制性信號通路減弱有關(guān)。本研究對心房顫動心肌纖維化大鼠給予過表達CXXC5處理，發(fā)現(xiàn)過表達CXXC5可升高心房顫動心肌纖維化大鼠心肌組織中CXXC5和Smad7水平，降低Ⅰ型膠原、TGF-β1水平，分析CXXC5可能通過TGF-β1/Smad7信號通路進而抑制心房顫動心肌纖維化的過程。

綜上所述，CXXC5水平下降可能是誘導(dǎo)心房顫動心肌纖維化的潛在機制，過表達CXXC5可能通過抑制TGF-β1/Smad7信號通路進而抑制心房顫動心肌纖維化，CXXC5有望成為心房顫動心肌纖維化的潛在靶點。