通過(guò)礦化提高蛋白疫苗穩(wěn)定性的研究①

閔婭君 肖云菊 肖江明 胥文春 尹一兵 張雪梅

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400016)

肺炎鏈球菌 (streptococcus pneumoniae，S.pn) 作為社區(qū)獲得性肺炎的主要致病菌，還可引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重的侵襲性疾病，而疫苗是預(yù)防傳染性疾病最經(jīng)濟(jì)、有效的手段[1]。蛋白疫苗因其保守性高、抗原性強(qiáng)、易于制備且能有效激活B、T細(xì)胞免疫等優(yōu)點(diǎn)，已成為下一代肺炎鏈球菌疫苗的研究重點(diǎn)[2，3]。但蛋白疫苗對(duì)溫度極其敏感，從生產(chǎn)到運(yùn)輸全過(guò)程都需要嚴(yán)格低溫保存，極大地增加了疫苗的使用成本，限制了疫苗的廣泛應(yīng)用[4]。因此，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對(duì)蛋白質(zhì)疫苗的應(yīng)用具有重要意義。

肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，PLY)是肺炎鏈球菌的一種重要毒力因子，作為膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶血素(CDCs)的家族成員，可廣泛作用于宿主組織細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。ΔA146PLY 作為PLY的無(wú)溶血活性突變體，被證明是一種安全高效的肺炎鏈球菌候選疫苗[5]。本研究擬以肺炎鏈球菌ΔA146PLY為研究對(duì)象，利用原位仿生礦化技術(shù)為其包裹上一層磷酸鈣外殼，通過(guò)酶解反應(yīng)和熱處理觀察其穩(wěn)定性，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估礦化疫苗ΔA146PLY@CaP的免疫保護(hù)效果，以進(jìn)一步確定其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與動(dòng)物 WT-PLYE.coliBL21和ΔA146PLYE.coliBL21菌株由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備與保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)購(gòu)自擎科生物科技有限公司；肺炎鏈球菌臨床菌株CMCC31693(血清型19F型)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；野生昆明鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6～8周齡C57BL/6雌性小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)清潔動(dòng)物房。

1.1.2試劑 Ni-NTA 樹(shù)脂購(gòu)自GE healthcare中國(guó)公司；去內(nèi)毒素試劑盒購(gòu)自南京金瑞斯生物科技；氯化鈣、氯化鎂購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購(gòu)自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；考馬斯亮藍(lán)(G-250,R-250)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Protein Molecular Weight Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)公司；預(yù)染marker購(gòu)自Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；SDS-PAGE試劑盒，青鏈霉素、卡那霉素購(gòu)自碧云天生物公司；RMPI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone 公司；胎牛血清購(gòu)自ScienCell；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根生化科技有限公司；ELISA MAXTMDeluxe SET mouse IL-6、TNF-α試劑盒購(gòu)自Biolegend公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.1.3儀器 掃描電鏡(FESEM，Hitachi SU8010)、透射電鏡(TEM，Hitachi H-7500)，能量色散X射線光譜儀(EDS，Oxford Instruments)；紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific,Nanodrop 1000)；冷凍干燥機(jī)(CHRIST,RVC2-18); 酶標(biāo)儀(Gene Company Limited,EON)。

1.2方法

1.2.1蛋白WT-PLY和ΔA146PLY的表達(dá)純化與內(nèi)毒素去除 將E.coliBL21-WT-PLY和E.coliBL21-ΔA146PLY 菌株活化于5 ml含50 ng/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床，37℃，180 r/min。A600≈0.5(約7 h)時(shí)將5 ml活化菌液加入到含卡那霉素終濃度為50 ng/ml的500 ml LB培養(yǎng)基中，置于搖床，37℃，180 r/min。搖床培養(yǎng)約4 h后加入1 mol/L IPTG至終濃度0.5 mmol/L，25℃，120 r/min誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 h。5 000 r/min，4℃離心收集細(xì)菌，超聲破菌后以4℃ 12 000 r/min離心30 min并收集上清，0.22 μm濾器過(guò)濾；Ni-NTA親和層析法進(jìn)行蛋白純化，超濾后用試劑盒去內(nèi)毒素并用10%SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所得蛋白濃度，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蛋白WT-PLY和ΔA146PLY的生物礦化 將 360 μg蛋白WT-PLY和ΔA146PLY分別與8.8 μmol CaCl2、8.8 μmol MgCl2以及5.28 μmol Na2HPO4/NaH2PO4(pH=7.5)緩沖液混合，其余體積用ddH2O(pH=7.5)補(bǔ)足至1 ml。用DEPC處理過(guò)的磁珠與礦化體系盛放于燒杯，4℃攪拌4 h后備用。分別取礦化懸濁液40 μl，4℃ 3 000 r/min 離心5 min，分離上清和沉淀，40 μl上清中加入10 μl 5×loading buffer，沉淀中加入50 μl 1×loading buffer，沸水煮10 min，分別取20 μl樣本進(jìn)行SDS-PAGE分析。另外取部分礦化液，分離上清，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清中殘余的蛋白含量。

1.2.3礦化納米顆粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的表征

1.2.3.1TEM 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液分別用PBS稀釋50倍后，滴于200目銅網(wǎng)上，自然晾干，隨后在透射電鏡中檢測(cè)礦化蛋白的大小。

1.2.3.2FESEM 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液分別用無(wú)水乙醇稀釋10倍后，滴于二氧化硅玻片上，自然晾干后噴金，隨后掃描電鏡檢測(cè)礦化蛋白的表面形貌。

1.2.3.3EDS 將WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化懸濁液3 000 r/min離心后，棄上清，沉淀用無(wú)水乙醇清洗2遍后，置于冷凍干燥機(jī)凍干后將粉末送去檢測(cè)：將其鋪于碳膠帶上，采用EDS檢測(cè)礦化顆粒表面的元素組成。

1.2.4蛋白與納米顆粒的穩(wěn)定性檢測(cè)

1.2.4.1蛋白酶K降解實(shí)驗(yàn) 將WT-PLY蛋白和礦化后的WT-PLY@CaP懸濁液用40 μg/ml的蛋白酶K分別處理0、1、5、10、15 min，ΔA146PLY蛋白和ΔA146PLY@CaP用15 μg/ml的蛋白酶K分別處理0、1、5、10、15 min。加入1 μl FMSF終止酶解反應(yīng)，之后加入loading buffer，煮沸10 min后取20 μl上樣于SDS-PAGE的上樣孔中，80 V×40 min后120 V×80 min 跑膠。用考馬斯亮藍(lán)染色后再用洗脫液洗脫。

1.2.4.2溶血實(shí)驗(yàn) 取野生昆明鼠心臟血制備2%紅細(xì)胞懸液備用。將WT-PLY和WT-PLY@CaP分別放置在45℃、55℃處理不同時(shí)間后取20 μl蛋白及處理后的懸濁液到300 μl 2%紅細(xì)胞懸液中，反應(yīng)10 min，800 g離心5 min，取上清150 μl加入至96孔板，在545 nm處比色。

1.2.5小鼠巨噬細(xì)胞的提取與體外培養(yǎng) 吸取無(wú)菌石蠟1 ml，注入小鼠腹腔以刺激腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；5 d后斷頸處死小鼠于75%乙醇浸泡5 min；從下腹部側(cè)緣破開(kāi)腹腔，分別用7 ml+8 ml預(yù)冷的PBS沖擊腹腔，回收的PBS 1 000 r/min離心5 min，棄去上層石蠟，PBS洗1次之后，加入紅細(xì)胞裂解液5 ml，作用2 min，PBS洗3次，加入新鮮含雙抗(青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)基(DMEM)5 ml，計(jì)數(shù)并稀釋后鋪板于24孔板(5×105個(gè)/孔，500 μl/孔)；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜后每孔加入15 μl分別用45℃和55℃處理的ΔA146PLY和ΔA146PLY@CaP，以等量LPS作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌PBS作為陰性對(duì)照。

1.2.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1皮下免疫小鼠 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為8組，1.5%戊巴比妥鈉麻醉，共免疫 3次，每次免疫間隔14 d。

1.2.6.2鼻腔定植 末次免疫7 d后取20 μl含有1×108CFU的19F以滴鼻的方式攻毒，每組6只，72 h后在小鼠被麻醉的狀態(tài)下收集鼻腔灌洗液(100 μl/只)及肺勻漿(每組>4只)，分別鋪板計(jì)算細(xì)菌載量；肺勻漿12 000 r/min離心10 min后收集上清以檢測(cè)細(xì)胞因子含量。

1.2.7酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞因子及抗體水平 于末次免疫7 d后取小鼠尾靜脈血，分離血清用于檢測(cè)抗體效價(jià)；用抗原包被液將蛋白ΔA146PLY稀釋至5 μg/ml，加入96孔板，100 μl/孔，4℃過(guò)夜；洗板(洗液：0.05%PBST)3次，加入封閉液(2%BSA)，200 μl/孔，37℃×2 h；洗板3次后加末次免疫7 d后所得血清，進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋?zhuān)?00 μl/孔，最后一孔(100 μl，2%BSA)為陰性對(duì)照，37℃×1 h；洗板6次后加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，100 μl/孔，37℃×45 min；洗板6次后分別加入A、B顯色液各50 μl，37℃15 min；100 μl/孔、2 mol/L硫酸終止反應(yīng)；450 nm測(cè)定吸光度值；以A空白×2.1為臨界值，計(jì)算各小鼠的抗體效價(jià)滴度。IL-6、TNF-α的濃度均由ELISA MAXTMDeluxe SET mouse IL-6、TNF-α、試劑盒按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，在450 nm處比色測(cè)定吸光度值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)細(xì)胞因子含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)的作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用軟件Graphpad Prism(Prism 5；Graphpad Software，La Jolla,CA,USA)完成。抗體效價(jià)使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分析；細(xì)菌載量、細(xì)胞因子使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蛋白的表達(dá)與純化 通過(guò)肺炎鏈球菌溶血素PLY溶血活性的變化觀察蛋白礦化后的穩(wěn)定性，在表達(dá)ΔA146PLY的同時(shí)也表達(dá)其具野生型蛋白WT-PLY，以便于后續(xù)研究。以1 mol/L IPTG，20℃×120 r/min誘導(dǎo)表達(dá)蛋白WT-PLY和ΔA146PLY，Ni-NTA柱純化并用去內(nèi)毒素試劑盒去除蛋白的內(nèi)毒素(LPS<0.1 EU/μg)后以10% SDS-PAGE分析所得蛋白，G-250染色后于53 kD處見(jiàn)目的條帶，大小與相應(yīng)蛋白相對(duì)分子量相符，灰度分析顯示純度均達(dá)90%以上(圖1)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 蛋白WT-PLY和ΔA146PLY原核表達(dá)、純化后SDS-PAGE分析Fig.1 Prokaryotic expressions of WT-PLY and ΔA146 PLY and SDS-PAGE analysis after purificationNote:A.Protein WT-PLY; B.Protein ΔA146PLY.M.DL 200 kD marker; 1.WT-PLY protein；2.Protein ΔA146PLY.

圖2 礦化后蛋白納米顆粒的表達(dá)效果及SDS-PAGE、BCA結(jié)果Fig.2 Expression of protein nanoparticles after mineralization and SDS-PAGE,BCA resultsNote:A.Comparison of WT-PLY mineralization effect (1.WT-PLY; 2.WT-PLY@CaP); B.WT-PLY@CaP SDS-PAGE analysis (M.Protein marker; 1.WT-PLY; 2.WT-PLY@CaP supernatant; 3.WT-PLY@CaP precipitation); C.WT-PLY@CaP BCA test result chart; D.Comparison of ΔA146PLY mineralization effect (1.ΔA146PLY; 2.ΔA146PLY @CaP); E.ΔA146PLY@CaP SDS-PAGE analysis (M.Protein marker; 1.ΔA146PLY;2.ΔA146PLY@CaP supernatant; 3.ΔA146PLY@CaP precipita-tion);F.ΔA146PLY@CaP BCA test results.

2.2蛋白的生物礦化及包封率分析 礦化結(jié)果顯示：蛋白礦化后呈懸濁液，與蛋白溶液相比，呈現(xiàn)比較明顯的半透明狀(圖2A、D)。分離礦化液上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE，灰度分析結(jié)果顯示W(wǎng)T-PLY@CaP上清中蛋白含量為51.3%，沉淀中為40.6%；ΔA146PLY@CaP蛋白含量為51.6%，沉淀中為44.7%(圖2B、E)。將礦化懸濁液的上清液用BCA試劑盒檢測(cè)， WT-PLY上清中含量為55.6%，ΔA146PLY含量為47.8%，即生物礦化之后的包封率分別為44.4%和52.2%(圖2C、F)。

2.3礦化納米顆粒的生物表征

2.3.1TEM 可溶性蛋白WT-PLY和ΔA146PLY是柔性分子，分子直徑約20 nm，因其不能承受普通透射電子顯微鏡高速的電子束轟擊，所以無(wú)法通過(guò)TEM觀測(cè)其大小。但是經(jīng)過(guò)原位礦化之后，礦化顆粒具有一定的厚度和體積，在電子束轟擊下不會(huì)降解分離，可以在電鏡下呈現(xiàn)出一定的大小和形態(tài)。通過(guò)TEM觀察產(chǎn)物大小和形狀(圖3)，發(fā)現(xiàn)磷酸鈣-蛋白質(zhì)的復(fù)合物呈現(xiàn)為單分散的近球形納米顆粒，大小不一，直徑約100 nm。

圖3 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的TEM圖

圖4 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的FESEM圖

2.3.2FESEM 通過(guò)FESEM觀察產(chǎn)物表面形貌(圖4)，發(fā)現(xiàn)磷酸鈣-蛋白質(zhì)的復(fù)合物呈現(xiàn)為表面較光滑的近球形納米顆粒，盡管大小不一，但是大多數(shù)直徑100 nm左右，同TEM的結(jié)果相似。

圖5 WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的EDS圖

圖6 蛋白WT-PLY、ΔA146PLY及其礦化顆粒蛋白酶K處理后SDS-PAGE結(jié)果分析

2.3.3EDS EDS分析結(jié)果(圖5)表明蛋白磷酸鈣納米復(fù)合物中含有Ca、Mg、P等元素，其中WT-PLY@CaP Ca、Mg、P的含量分別為41.94%、15.86%、42.21%；ΔA146PLY @CaP Ca、Mg、P的含量分別為49.38%、7.69%、42.93%(鈣磷比約為1∶1)，這也進(jìn)一步證明生物礦化確實(shí)將磷酸鈣包裹于自身。

2.4蛋白與礦化顆粒的穩(wěn)定性評(píng)估

2.4.1蛋白酶K降解實(shí)驗(yàn) 對(duì)蛋白WT-PLY和礦化顆粒WT-PLY@CaP蛋白酶K處理后，可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白基本降解，但是礦化顆粒仍然殘留部分；同理，蛋白ΔA146PLY在15 min后幾乎無(wú)殘余，但是礦化顆粒相較于游離蛋白仍剩余較多(圖6)，而且降解速度上，無(wú)論WT-PLY@CaP還是ΔA146PLY@CaP，其抵抗蛋白酶作用的耐受性仍然高于游離蛋白WT-PLY以及ΔA146PLY。

圖7 熱處理后WT-PLY和WT-PLY@CaP的溶血對(duì)比圖

圖8 不同溫度處理ΔA146PLY和ΔA146PLY@CaP后刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6和TNF-αFig.8 Treatment of cytokines IL-6 and TNF-α by macrophages after treatment with ΔA146PLY and ΔA146PLY@CaP at different temperaturesNote:*.P<0.05;**.P<0.01；***.P<0.001.

圖9 礦化蛋白熱處理后小鼠的免疫保護(hù)效應(yīng)Fig.9 Immune protective effect of mice after heat treatment of mineralized proteinNote:A.Anti-ΔA146PLY IgG antibody titer of subcutaneous immunized mice after heat treatment of mineralized protein;B.Colony count of nasal lavage fluid after 72 h of nasal infection;C,D.Inflammation of the lung produces IL-6 and TNF-α levels after 72 h of nasal infection.Compared with the PBS group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with the ΔA146PLY group,★.P<0.05;compared with the ΔA146PLY inactivation treatment group,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.4.2溶血實(shí)驗(yàn) 采用溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白的熱穩(wěn)定性評(píng)估，結(jié)果顯示在55℃處理后，WT-PLY蛋白在3 min后完全失活，而WT-PLY@CaP在20 min之后仍保留部分溶血活性；45℃處理后，WT-PLY蛋白在0.5 h后完全失活，而WT-PLY@CaP在24 h后仍然保留有部分溶血活性。結(jié)果顯示，生物礦化后的WT-PLY@CaP可以提高WT-PLY蛋白在較高溫度下的熱穩(wěn)定性(圖7)。

2.5礦化蛋白熱處理后仍可有效激活巨噬細(xì)胞 采用疫苗蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞的激活效應(yīng)探索礦化蛋白對(duì)熱的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：在較高溫度處理后的蛋白基本失去刺激活性，但是進(jìn)行生物礦化之后的ΔA146PLY@CaP仍然可以刺激巨噬細(xì)胞分泌較高的IL-6和TNF-α，具有明顯的差異(圖8)，提示ΔA146PLY進(jìn)行生物礦化之后可顯著提高蛋白在較高溫度下的熱穩(wěn)定性。

2.6礦化蛋白熱處理后仍可誘導(dǎo)小鼠的免疫保護(hù)效應(yīng) 采用免疫保護(hù)作用進(jìn)行蛋白熱穩(wěn)定性評(píng)估，結(jié)果顯示(圖9A)熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未經(jīng)處理組蛋白ΔA146PLY相比無(wú)差異，都具有較高的抗體效價(jià)，熱處理后的ΔA146PLY抗體效價(jià)較未處理組顯著降低，提示生物礦化之后的蛋白確實(shí)能抵抗較高的溫度，且在處理后仍具有生物活性。

鼻腔灌洗液結(jié)果顯示(圖9B)，熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未處理組蛋白ΔA146PLY的菌落計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，都較PBS組和蛋白滅活處理組顯著降低(P<0.01)；熱處理之后的ΔA146PLY@CaP(45℃和55℃)與未處理蛋白ΔA146PLY的IL-6和TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，都較對(duì)照組(滅活蛋白組、ACP加蛋白組和PBS組)的水平顯著降低。這些結(jié)果提示，熱處理后的ΔA146PLY@CaP可以降低肺炎鏈球菌鼻咽部定植量，仍可以保持與原蛋白相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)效應(yīng)。

3 討論

目前，提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的方法主要有以下幾種：①非共價(jià)修飾，主要是通過(guò)物理方法提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，包括反相膠束法、凍融法和凍干法等[6,7]；②化學(xué)修飾，主要是通過(guò)化學(xué)手段將其他分子共計(jì)連接到蛋白質(zhì)分子上，以改變它們的生物分配行為和溶解行為，從而增強(qiáng)藥物的物理、化學(xué)和生物穩(wěn)定性，包括化學(xué)交聯(lián)、聚合物修飾、小分子修飾等[8-12]；③添加蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，最簡(jiǎn)單有效的添加劑是離子化合物的鹽類(lèi)，離子的結(jié)合能增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，鹽類(lèi)通過(guò)與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合，減緩蛋白質(zhì)的變性；④蛋白質(zhì)工程，通過(guò)化學(xué)、物理、分子生物學(xué)手段對(duì)基因進(jìn)行修飾或合成新的基因，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行高度專(zhuān)一的改造，從而起到增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用[13]；⑤在液體狀態(tài)，利用礦化技術(shù)直接在蛋白表面形成磷酸鈣礦化外殼以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。然而，方法①在凍融或凍干蛋白過(guò)程中易使蛋白分解失活；方法②③④一般需要復(fù)雜的處理過(guò)程且普適性低；方法④尚不能產(chǎn)生良好的保護(hù)效果，而且可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，影響蛋白質(zhì)的效果。方法⑤的策略是模擬自然現(xiàn)象給蛋白分子加上一層具有保護(hù)作用的礦化外殼。生物礦化在自然界中普遍存在，生物體通過(guò)生物礦化形成具有一定結(jié)構(gòu)的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合組分，為較脆弱的本體提供機(jī)械支持和保護(hù)，提高它們?cè)诓焕h(huán)境中的穩(wěn)定性[14]。該法相對(duì)簡(jiǎn)便易行，在病毒和細(xì)菌等活的生物體中都有良好的效果[15,16]。目前被用于礦化研究的物質(zhì)有多種類(lèi)型，包括磷酸鈣、碳酸鈣、二氧化硅等，其中磷酸鈣為生物體內(nèi)所熟知的骨骼、牙齒的主要成分，以磷酸鈣作為藥物材料具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性[17-22]。同時(shí)磷酸鈣也可以作為佐劑來(lái)促進(jìn)免疫抗原的作用效果，且不會(huì)像鋁佐劑一樣引起較大的局部組織刺激[23，24]。納米級(jí)的蛋白磷酸鈣制劑因具有可被免疫細(xì)胞攝取和遞呈引發(fā)免疫反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)而具有廣闊的應(yīng)用前景[25]。因此，采用磷酸鈣制備生物礦化殼是一種良好的選擇。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，蛋白質(zhì)的原位礦化是分別取360 μl WT-PLY蛋白和ΔA146PLY蛋白(1 mg/ml)與88 μl CaCl2(0.1 mol/L，pH=7.5)和Na2HPO4/NaH2PO4(0.1 mol/L，pH=7.5)以及ddH2O(pH=7.5)組成1 ml礦化體系，用攪拌子在4℃勻速攪拌4 h形成WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP礦化顆粒。因?yàn)榍捌趯?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)礦化體系不穩(wěn)定，所以在礦化反應(yīng)體系中加入88 μl MgCl2(0.1 mol/L)作為礦物無(wú)定形相的穩(wěn)定劑，抑制礦物發(fā)生相轉(zhuǎn)變[26]。Mg2+可以通過(guò)摻雜于無(wú)定形磷酸鈣顆粒內(nèi)部或吸附于顆粒表面起到穩(wěn)定礦物無(wú)定形態(tài)的作用[27]。

但是遺憾的是，雖然鎂離子可以提高礦化體系的穩(wěn)定性，但是礦化顆粒在37℃放置14 d后以及25℃放置60 d后并沒(méi)有表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，其可能與本研究的體系尚不完全穩(wěn)定有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)放置多天后，礦化顆粒聚集沉淀，顆粒顯著增大，且不能恢復(fù)成納米狀態(tài)。因此，擬采用添加穩(wěn)定劑的方法來(lái)提高，之前嘗試添加蔗糖、聚乙二醇(不同分子量、不同濃度)、PVP等，都沒(méi)有顯著提高礦化體系的穩(wěn)定性。所以，本課題組擬再選擇其他穩(wěn)定劑或是將以上穩(wěn)定劑的濃度更改之后再進(jìn)一步研究。另外，也可能是蛋白自身的結(jié)合能力較弱，本課題組擬偶聯(lián)礦化肽提高其磷酸鈣的結(jié)合能力，或許能獲得更穩(wěn)定的礦化蛋白。

本研究通過(guò)較為簡(jiǎn)便的原位礦化技術(shù)進(jìn)行生物礦化后，蛋白可以形成具有礦化外殼的納米顆粒，該納米顆粒具有一定的抗蛋白酶K降解能力和高溫耐受性?！鰽146PLY疫苗蛋白形成的礦化納米顆粒在45℃和55℃處理后仍保持與原蛋白一致的免疫活性。本研究也為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)制劑的制備提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。