子宮內(nèi)膜漿液性癌通過免疫組化和原位雜交檢測HER2/neu蛋白過表達(dá)與基因擴(kuò)增的對照及可行性研究*

張建筑，袁士成，彭曉峰，趙文麗，易智君，劉鏡文，楊 紅，秦文華，侯衛(wèi)華

1.惠州市第一人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516000；2.惠州市中心人民醫(yī)院病理科，廣東 惠州 516000；3.惠州市第一婦幼保健院病理科，廣東 惠州 516000；4.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467000；5.解放軍第989醫(yī)院病理科，河南 平頂山 467000

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)中較常見的腫瘤，ESC約占所有子宮內(nèi)膜癌的8.7%～10.2%。ESC惡性程度高，對常規(guī)化療藥物易出現(xiàn)耐藥，治療效果差，復(fù)發(fā)率高。約50%病例確診時已伴有子宮外病變，此部分病例中，約30%～50%未發(fā)現(xiàn)明確的子宮肌層浸潤［1］。在精準(zhǔn)醫(yī)療時代，為降低ESC患者的復(fù)發(fā)及死亡率，有必要對可能存在的靶向治療的靶點(diǎn)HER2/neu進(jìn)行研究。在乳腺癌和胃癌中，人表皮生長因子受體2（HER2/Neu，C-ERBB2）HER2蛋白過表達(dá)和（或）擴(kuò)增病例，其評價標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)用靶向藥物曲妥珠單抗治療的規(guī)范化流程和治療效果已得到確認(rèn)［2-4］。針對HER2表達(dá)的異質(zhì)性研究，反映這些腫瘤的獨(dú)特的生物特征和預(yù)測對HER2靶向治療的臨床效果［5-8］也取得了一些成果。雖然HER2/neu的子宮內(nèi)膜癌的研究已經(jīng)近20年，但并沒有形成完整的評價標(biāo)準(zhǔn)和指南，以致在子宮內(nèi)膜癌中抗HER2藥物的應(yīng)用沒有準(zhǔn)確的HER2/neu擴(kuò)增狀態(tài)的依據(jù)，研究得到的結(jié)果受到質(zhì)疑［9-16］。如有研究HER2過表達(dá)或HER2擴(kuò)增均與無進(jìn)展生存期或總生存期無關(guān)［17］；還有部分研究提示，曲妥珠單抗作為單一藥物并未顯示出對具有HER2過表達(dá)或HER2擴(kuò)增的子宮內(nèi)膜癌的活性。在所有此類研究中，HER2過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增的病例所占各自研究病例的14%～80%，從這些結(jié)論中可以肯定的推斷，至少有部分研究在對HER2過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增的評價標(biāo)準(zhǔn)和解讀是存在錯誤的［9-15］。所以，對HER2/neu基因狀態(tài)的準(zhǔn)確評估非常重要，將嚴(yán)格篩選的HER2/neu蛋白過表達(dá)和/或基因擴(kuò)增病例入組抗HER2藥物治療，所得到的療效結(jié)果才是準(zhǔn)確可靠的［18］。近年來，有研究顯示，二代抗HER2/neu藥物如達(dá)可替尼、阿法替尼等對化療耐藥的HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC顯著有效［19-20］；絡(luò)氨酸酶抑制劑與抗HER2藥物的聯(lián)合應(yīng)用以及卡鉑-紫杉醇聯(lián)合曲妥珠單抗在治療ESC的研究也取得了很大的進(jìn)展［21-24］。因此，有必要對新型抗HER2/neu藥物在對化療耐藥的HER2/neu基因擴(kuò)增ESC患者中臨床應(yīng)用進(jìn)行研究。基于以上情況，我們采用ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測指南評分標(biāo)準(zhǔn)，對ESC病例HER2過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增情況進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2018年5月間71例惠州市第一人民醫(yī)院及四家友好醫(yī)院（惠州市中心人民醫(yī)院、惠州市婦幼保健院、平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院、解放軍第989醫(yī)院）初發(fā)ESC手術(shù)切除標(biāo)本蠟塊，所有患者術(shù)前均未做放、化療，病人年齡50～82歲。免疫組化：一抗為上?；蚬就每谷薍ER2，SP3單克隆抗體；其它所需配套試劑來自Leica（德國）公司；全自動免疫組化儀為Leica BOND-Ⅲ，來自Leica（德國）公司。FISH檢測所用HER2-DNA探針試劑盒為Histra HER2 FISH Kit試劑盒，購自日本常光公司。免疫組化及FISH操作步驟均嚴(yán)格參照儀器使用流程和試劑使用說明。

1.2 方法

（1）所選用標(biāo)本蠟塊均為嚴(yán)格按照FISH及IHC固定要求（離體時間小于30 min，充分剖開，組織體積10倍左右4%中性甲醛固定6-48 h）。（2）常規(guī)石蠟切片，HE染色、IHC切片厚度均為4μm。（3）IHC染色采用乳腺癌評分HER2（3+）和HER2（0）做為陽性、陰性對照，染色評價后，按照ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南評分標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判讀，按評分分為4組（3+組、2+組、1+組、0組），選取每個蠟塊IHC表達(dá)最強(qiáng)部分直徑0.4 cm組織，組內(nèi)優(yōu)先原則，每4塊組織同乳腺癌陽性、陰性（FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)）對照制作一個組織芯片，組內(nèi)不足4塊則由其他組補(bǔ)入，最終制作組織芯片18個，供FISH實(shí)驗(yàn)使用。（4）組織芯片F(xiàn)ISH切片厚度為4μm。

1.3 結(jié)果判定

參照ASCO/CAP2013版乳腺癌HER2檢測指南［25］的判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）免疫組化化學(xué)。HER2蛋白表達(dá)陽性HER2（3+）：≥10%腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的膜陽性；HER2蛋白表達(dá)不確定HER2（2+）：≤10%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)而完整的膜陽性和/或＞10%細(xì)胞出現(xiàn)不完整的弱至中等強(qiáng)度的細(xì)胞膜染色；HER2蛋白表達(dá)陰性HER2（1+）、HER2（0）：＞10%的浸潤性癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色判度為HER2（1+）；腫瘤完全陰性或≤10%細(xì)胞出現(xiàn)不完整、微弱的細(xì)胞膜染色判讀為HER2（0）?！咀ⅲ涸诒敬窝芯恐?，將IHC中強(qiáng)的U型著色（基底膜和側(cè)膜著色）判定等同于完整的膜陽性；將染色強(qiáng)度（5個級別：無信號、微弱表達(dá)、弱表達(dá)、中等輕度表達(dá)、強(qiáng)表達(dá)）差異至少占腫瘤5%的比例定義為免疫組化染色異質(zhì)性】。（2）FISH HER2/neu基因擴(kuò)增：HER2/CEP17≥2.0和/或HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥6，若HER2/neu信號連成簇，則不用計算比值，直接判定為HER2/neu基因擴(kuò)增；HER2/neu基因未擴(kuò)增：HER2/CEP17＜2.0且HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)＜4；HER2/neu基因擴(kuò)增不確定：HER2/CEP17＜2.0且6＞HER拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥4。FISH/HER2蛋白符合率：HER2/neu擴(kuò)增數(shù)+HER2/neu基因未擴(kuò)增數(shù)/HER2（3+）+HER2（1+）+HER2（0）；HER2/neu基因擴(kuò)增率：HER2/neu基因擴(kuò)增數(shù)/病例總數(shù)。（注：本次HER2/neu的免疫組化結(jié)果和FISH結(jié)果均由兩名有資質(zhì)醫(yī)師單獨(dú)閱片，最后兩人得出的結(jié)果進(jìn)行參照、對比，不一致病例進(jìn)行討論、重新評估，最終得出結(jié)果）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER2IHC評分分布及HER2/neu FISH結(jié)果的對照

所有71例病例均進(jìn)行免疫組化HER2蛋白和FISH基因擴(kuò)增檢測。根據(jù)ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南進(jìn)行評分，其中HER2（3+）18例；HER2（2+）17例；HER2（1+）26例；HER2（0）10例；其中有24例病例出現(xiàn)IHC表達(dá)的異質(zhì)性。應(yīng)用FISH實(shí)驗(yàn)檢測：HER2（3+）病例中有16例HER2/neu基因擴(kuò)增， 1例未擴(kuò)增，1例HER2/neu基因擴(kuò)增不確定；HER2（2+）病例中，4例HER2/neu基因擴(kuò)增，11例HER2/neu基因未擴(kuò)增，2例HER2/neu基因擴(kuò)增不確定；HER2（1+）病例中，1例HER2/neu基因擴(kuò)增，25例HER2/neu基因未擴(kuò)增；HER2（0）病例中，HER2/neu基因擴(kuò)增病例數(shù)為0。除去HER2（2+）不確定病例，F(xiàn)ISH/HER2免疫組化符合率為94.4%（51/54），HER2基因擴(kuò)增率為29.5%（21/71），見表1，圖1。通過FISH檢測我們還發(fā)現(xiàn)，有45.1%（32/71）的病例顯示17號染色體多體（HER2/CEP17＞2.5）。

表1 HER2IHC評分分布及HER2/neu FISH結(jié)果的對照 例

2.2 HER2IHC異質(zhì)性與基因擴(kuò)增對照

在IHC評分中，有24例病例出現(xiàn)了ICH表達(dá)的異質(zhì)性，其中有11例（52.4%，11/21）HER2/neu基因擴(kuò)增病，HER2/neu未擴(kuò)增及不確定病例中IHC表達(dá)異質(zhì)性所占比例為（26%，13/50），二者間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.065），見表2，圖1。

表2 HER2IHC異質(zhì)性與基因擴(kuò)增對照 例(%)

圖1 子宮內(nèi)膜漿液性癌的HER2免疫組化表達(dá)和HER2/neu基因擴(kuò)增

3 討論

本次研究得出了三個結(jié)論：（1）ESC中應(yīng)用ASCO/CAP 2013版乳腺癌HER2檢測指南進(jìn)行判讀，F(xiàn)ISH基因擴(kuò)增檢測和IHC免疫組化過表達(dá)情況有高度的一致性94.4%（51/54）；（2）在ESC中，有29.5%的病例出現(xiàn)HER2/neu基因擴(kuò)增；（3）在ESC中，HER2蛋白的IHC表達(dá)存在較高的異質(zhì)性33.8%（24/71）。

正確評估靶向藥物靶點(diǎn)的狀態(tài)對入組靶向藥物治療起決定性作用。乳腺癌和胃癌的HER2檢測指南已經(jīng)完備并隨著研究進(jìn)展不斷更新，ASCO/CAP在2018年對乳腺癌HER2檢測指南進(jìn)行了更新［26］，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)的更新，中國乳腺癌專家組制定了《乳腺癌HER2檢測指南（2019版）》［27］。目前國內(nèi)外尚無針對ESC的HER2檢測指南及抗HER2靶向藥物的應(yīng)用規(guī)范。漿液性子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜癌最具生物學(xué)攻擊性的變體，具有較高的復(fù)發(fā)率和對常規(guī)化療的相對耐藥性，這對腫瘤科醫(yī)生提出了重大的治療挑戰(zhàn)［28-30］。在以往子宮內(nèi)膜漿液性癌HER2研究中，缺乏規(guī)范的HER2檢測標(biāo)準(zhǔn)來顯示HER2/neu的基因狀態(tài)，導(dǎo)致研究中HER2過表達(dá)率在14%～80%［8-12,31-36］，這種不規(guī)范性主要體現(xiàn)在，部分研究沒有將Ⅰ型、Ⅱ型子宮內(nèi)膜樣癌分開研究，甚至有人將惡性苗勒氏混合瘤也納入研究組中［8-16］。雖然部分研究是依照ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南或FDA（食品藥品管理局）標(biāo)準(zhǔn)對IHC結(jié)果進(jìn)行判讀，但有的將HER2蛋白評分（2+）和（3+）的病例完全納入HER2/neu基因擴(kuò)增病例，對HER2狀態(tài)的評估的不規(guī)范，導(dǎo)致最后應(yīng)用抗HER2靶向藥物的療效產(chǎn)生不同的結(jié)果。近年來一些研究顯示，應(yīng)用新型抗HER2/neu基因的靶向藥物或聯(lián)合應(yīng)用絡(luò)氨酸激酶抑制劑等其它藥物，會使HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC病人受益［21-24］。

本研究是基于ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南對ESC的HER2/nue的IHC蛋白表達(dá)和FISH基因擴(kuò)增進(jìn)行的，研究顯示，ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南應(yīng)用于評價ESC的HER2/neu基因擴(kuò)增情況時，除去IHC判讀HER2（2+）病例，IHC和FISH符合率為94.4%（51/54），有較高的符合率，說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南在檢測ESC的HER2/neu基因狀態(tài)是適用的。

HER2/neu的IHC表達(dá)和基因擴(kuò)增特征在不同組織來源和組織學(xué)類型會有差異。在乳腺癌中，同一腫瘤中HER2/neu的IHC表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增的一致性比較高，出現(xiàn)表達(dá)和（或）擴(kuò)增的異質(zhì)性比較少見［37-38］；但是在胃癌中，許多病例HER2/neu的IHC表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增狀態(tài)在同一腫瘤內(nèi)的不同區(qū)域會顯示出明顯的異質(zhì)性［39］。針對IHC蛋白表達(dá)的異質(zhì)性，在胃癌的活檢標(biāo)本中對于HER2/nue表達(dá)評價有專門的指導(dǎo)意見，在活檢標(biāo)本中，只要存在成簇的至少5個腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞膜著色，即可判定為HER2（3+）［8］。在我們的研究中，ESC的HER2/nue蛋白表達(dá)與胃癌相似，較多病例表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性，僅在HER2/neu基因擴(kuò)增的病例中，就有52.4%（11/21）。我們得到的數(shù)據(jù)，可以對子宮內(nèi)膜診刮標(biāo)本中HER2/neu的HER2/neu的免疫組化表達(dá)評價提供類似胃癌的建議。由于ESC中的IHC蛋白表達(dá)存在比例較高的異質(zhì)性，所以我們建議：對于ESC的HER2/neu的蛋白過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增狀態(tài)的評估應(yīng)采取大切片或多切片。

在胃癌病例中，會出現(xiàn)HER2/neu蛋白IHC表達(dá)只在基底膜和側(cè)膜著色，而頂膜不著色，出現(xiàn)“U”形染色。在子宮內(nèi)膜漿液性癌中，也出現(xiàn)類似胃癌中的“U”形染色模式，尤其是在分化較好的、具有明確的腺管樣結(jié)構(gòu)的腫瘤或腫瘤區(qū)域。我們的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南，把“U”型染色等同于完整膜染色，HER2（3+）的病例經(jīng)FISH檢測HER/neu均擴(kuò)增。證明根據(jù)“U”形染色陽性強(qiáng)度和比例來對HER2/neu的IHC進(jìn)行評分是可行的。

綜上所述，在ESC中，評價HER2/neu的IHC過表達(dá)和/或基因擴(kuò)增情況，應(yīng)用ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南進(jìn)行判讀，IHC和FISH結(jié)果取得了較高的一致性，說明ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南是可以應(yīng)用于ESC的HER2/neu的過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增評估的；HER2/neu蛋白的IHC表達(dá)，存在在同一ESC腫瘤中較大比例的異質(zhì)性，因此建議腫瘤應(yīng)大切片、多取材；“U”型染色在ESC中，在ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南評價標(biāo)準(zhǔn)下，可等同完整的膜染色。隨著對HER2/neu的研究，針對HER2/neu基因擴(kuò)增的ESC病例的治療管理模式需要轉(zhuǎn)變［40］。本次研究僅進(jìn)行了HER2/neu免疫組化染色和FISH結(jié)果的對比及ASCO/CAP 2013乳腺癌HER2檢測指南在ESC中使用的可行性的研究，HER2/neu蛋白過表達(dá)和（或）基因擴(kuò)增病例應(yīng)用抗HER2藥物后治療效果的評價還有待于進(jìn)一步研究。