TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)性研究

趙宇青，何其勇，國麟祺

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002

TGF-β能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，TGF-β超家族包括多種TGF-β同種壓型，盡管結(jié)構(gòu)相似，但這些配體基于其細(xì)胞、組織特異性表達(dá)，它們與抑制性分子的相互作用以及它們與之復(fù)合的受體形成獨特組合而引起不同的生物反應(yīng)［1］。TGF-β1可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化已被廣大學(xué)者所接受［2-3］。TGF-β1是重要的促使上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化的因子［4］，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵因子,同時Smad2/3信號通路是TGF-β1作用的經(jīng)典通路之一。另有研究認(rèn)為，膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT是其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前的必經(jīng)之路［5-7］。故本研究就TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間相關(guān)性做如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膽管癌細(xì)胞QBC939（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）、TGF-β1誘 導(dǎo) 劑（Selleckchem）、RPMI1640（Transgenbiotech）、優(yōu)質(zhì)胎牛血清（HyClone），其余實驗材料均來自佳木斯大學(xué)實驗室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，于37℃、5%CO2、95%空氣的飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞可貼壁生長，每天多次于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，并適時更換培養(yǎng)液。

1.3 TGF-β1誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT

將膽管癌細(xì)胞QBC939消化離心后制成細(xì)胞懸液，向6孔板中接種，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。使細(xì)胞生長均勻，直至貼壁。待顯微鏡下觀察細(xì)胞已長至6孔板底壁的80%左右，向瓶中加入約2 m l RPMI-1640培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞12 h過夜后加入TGF-β1母液。將實驗組分為三組，分別設(shè)置濃度為1.0、5.0和10.0 ng/mL TGF-β1母液進(jìn)行培養(yǎng)，對照組僅用含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別于12、24和48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。選取變化最明顯的一組，用Western Blot法檢測E-cadherin及N-cadherin表達(dá)情況。

1.4 劃痕愈合實驗測定遷移能力

取對數(shù)期生長細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為5×105個/m l，將細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞鋪滿板底后，用200μl槍頭垂直標(biāo)記線劃痕，加入PBS沖洗3遍，去除劃下的細(xì)胞，按對照組（只加含胎牛血清培養(yǎng)基）、TGF-β1（1 ng/m l組、5 ng/m l組10 ng/m l組）分為四組，分別處理后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Image J軟件測量0 h和24 h劃痕寬度的變化，用閉合率代表各組的細(xì)胞遷移能力，閉合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 MTT檢測增殖能力

細(xì)胞培養(yǎng)到細(xì)胞生長對數(shù)期時進(jìn)行對比試驗，取200 μl膽管癌細(xì)胞株QBC939懸浮液接種到96孔板。接種的要求：2 000個/孔、每組設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔，將細(xì)胞放置于TGF-β1（1、5、10 ng/m l）進(jìn)行處理，12 h后，取出一塊板塊中的每孔加入5 mg/m l MTT 20μl，而后按照正常的細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，遺棄孔內(nèi)上清液，加入150μl DMSO，振蕩8 min使結(jié)晶物充分溶解。按照上述實驗辦法，分別做經(jīng)歷TGF-β1處理24 h、48 h、72 h的試驗。而后用酶標(biāo)儀上檢測，檢測辦法為：630nm波長為參考值，在490 nm波長處測定吸光度A值，重復(fù)三次。增值率=［（實驗組A值-調(diào)零孔A值/對照組A值-調(diào)零孔A值）-1］×100%。

1.6 Western blot檢測TGF-β1-Smad信號通路下游相關(guān)蛋白表達(dá)

培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用胰酶消化，計數(shù)后按每孔0.1×106鋪于12孔板，第2天細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合。實驗設(shè)置對照組（只加含胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)基），TGF-β1組加入終濃度為5 ng/m l的TGF-β1誘導(dǎo)48 h，待膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT后，各組細(xì)胞用冰預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液分別裂解，離心收集上清。調(diào)整各個提取樣本的總蛋白濃度為2μg/m l，取20μl總蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，用TBST洗膜(3次)，用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，由凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用ImageJ軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

計量數(shù)據(jù)以例數(shù)百分比（%）表示，兩個獨立樣本組間均數(shù)比較用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT

分別利用不同濃度（1.0、5.0和10.0 ng/m l）TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞，在不同時間點（12、24、48 h）利用相差光學(xué)顯微鏡評估TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，QBC939細(xì)胞培養(yǎng)在空白對照組呈現(xiàn)經(jīng)典的鵝卵石上皮形態(tài)和生長模式，5 ng/m l TGF-β1在24 h可以使QBC939細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，48 h之后更加顯著。經(jīng)過10 ng/m l TGF-β1處理后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，極性喪失，細(xì)胞變得離散，呈現(xiàn)更多的纖維母細(xì)胞形態(tài)并減少了細(xì)胞間的連接（圖1）。選取TGF-β1 10ng/m l組中的膽管癌細(xì)胞進(jìn)行Western blot試驗，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中細(xì)胞黏附分子E-cadherin蛋白水平下降（P＜0.05），而N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖2-1和圖2-2），證明在此過程中TGF-β1誘導(dǎo)QBC939細(xì)胞發(fā)生了EMT。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 鏡下觀察各濃度TGF-β1培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞各時間點細(xì)胞形態(tài)

圖2-1 Western blot試驗檢測各組QBC939細(xì)胞E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)情況

圖2-2 對照組與TGF-β1組E-cadherin及N-cadherin蛋白相對表達(dá)量

2.2 TGF-β1可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞遷移

1ng/m l組膽管癌細(xì)胞閉合率為（43.37±0.14）%；5 ng/m l組膽管癌細(xì)胞閉合率為（63.26±0.37）%；10 ng/m l組膽管癌細(xì)胞閉合率為（72.94±0.56）%，均高于對照組閉合率（34.64±0.75）%（圖3），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各濃度TGF-β1培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞后各組膽管癌細(xì)胞遷移情況

2.3 TGF-β1可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖

與對照組比較，1、5、10ng/m l組在不同時間點所測出的增值率均大于對照組（表1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 對照組與TGF-β1不同濃度組膽管癌細(xì)胞增值率 %

2.4 膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT后TGF-β1-Smad信號通路下游蛋白表達(dá)增加

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的REB中，TGF-β1-Smad信號通路下游相關(guān)蛋白P21WAF、VEGF、TSP-1、uPA、smad、Bmi-1表達(dá)均較對照組增加（圖4和圖5），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT前后TGFβ1-Smad信號通路下游蛋白表達(dá)量

圖5 Western blot試驗檢測膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT前后TGFβ 1-Smad信號通路下游蛋白表達(dá)情況

3 討論

膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤,在解剖學(xué)上分為肝內(nèi)、肝外和肝門部膽管癌。膽管癌早期診斷較消化系統(tǒng)其他部位惡性腫瘤困難，且進(jìn)展較其他惡性腫瘤迅速且該部位解剖關(guān)系復(fù)雜。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示膽道系統(tǒng)惡性腫瘤惡性程度及其發(fā)病率與胰腺癌相仿。除外科手術(shù)治療外，該病對化療藥物及放療治療均不敏感［8］。其可沿膽管上下組織間隙、淋巴管引流和周圍神經(jīng)鞘侵潤［9］。臨床上缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物，絕大多數(shù)患者明確診斷時已失去手術(shù)根治的機(jī)會［10］。目前并無確實有效的方法對膽管癌未手術(shù)患者進(jìn)行抗腫瘤治療［11］。研究表明膽管癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)。EMT是指在生理及病理情況下發(fā)生細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，同時伴隨細(xì)胞形態(tài)與相關(guān)基因表達(dá)的改變。在胚胎形成以及組織器官發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，同時也參與器官纖維化和腫瘤的形成［12］。EMT以上皮細(xì)胞極性的喪失及間質(zhì)特性的獲得為重要特征，同時使細(xì)胞在細(xì)胞功能及代謝等多個方面均發(fā)生改變。正常細(xì)胞間通過細(xì)胞的極性及E-cadherin的表達(dá)，形成細(xì)胞間的緊密和粘附連接，當(dāng)EMT發(fā)生時，細(xì)胞極性消失并獲得間質(zhì)特性，便可為腫瘤細(xì)胞通過基底膜創(chuàng)造機(jī)會。整個上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，上皮細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，如E-cadherin、p-連環(huán)素（p-Catenin）、a-連環(huán)素（a-Catenin）、c-連環(huán)素（c-Catenin）等；相反，間質(zhì)表型標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等，而N-cadherin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)有助于腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶［13-14］，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鑒于過度活化的TGF-β及其受體所介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路在肝癌、胰腺癌、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）等惡性腫瘤及組織纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。關(guān)于靶向抑制TGF-β的分子靶向治療成為科學(xué)研究的熱點所在。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使N-cadherin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而表現(xiàn)出間質(zhì)特性。還可以增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞的遷移及增值能力，且具有時間和濃度依賴性。這為膽管癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處提供了有利條件。而相對于一般膽管癌細(xì)胞而言，發(fā)生了EMT的膽管癌細(xì)胞中TGF-β1-Smad信號通路下游蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加，說明膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過程與該信號通路的異常激活密切相關(guān)。

綜上所述，TGF-β1在膽管癌細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中起到至關(guān)重要的作用，同時TGF-β1-Smad信號通路與膽管癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間具有相關(guān)性。抑制TGF-β1可能為研究膽管癌發(fā)生發(fā)展提供新的、潛在的依據(jù)。