小鼠激素敏感性脂肪酶基因啟動子報告質(zhì)粒的構(gòu)建*

李彥琦，左卓，高天暢，王貞締，侯永永

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 第一腫瘤內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032；2 中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110122）

脂代謝是指脂質(zhì)，如甘油三脂、膽固醇和磷脂等在體內(nèi)消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成、儲存和分解等生理過程。脂質(zhì)代謝紊亂與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如糖尿病、動脈粥樣硬化和腫瘤等[1-3]。脂肪的合成與分解是調(diào)控能量代謝的核心機(jī)制之一。當(dāng)機(jī)體處于能量過剩狀態(tài)時，脂肪合成增多；當(dāng)機(jī)體處于饑餓或交感神經(jīng)興奮時，腎上腺素、去甲腎上腺素和胰高血糖素等分泌增加，促進(jìn)脂肪動員。脂肪動員需要多種酶和蛋白參與，如圍脂滴蛋白1（Perilipin-1）、脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL）、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase, HSL）和甘油一酯脂肪酶（monoglyceride lipase, MGL）等[4-5]。HSL 除在胰腺和睪丸等組織中表達(dá)外，主要由脂肪細(xì)胞生成，其催化甘油二酯生成甘油一酯和脂肪酸，是脂肪分解的關(guān)鍵酶之一[4-6]。

HSL 的活化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控是研究脂肪分解的關(guān)鍵，早期的報道顯示過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）能與HSL 基因啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控HSL 的轉(zhuǎn)錄，是已確認(rèn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[7]?？紤]HSL 在脂肪分解過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用，尋找能夠調(diào)控HSL 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的臨床藥物、小分子化合物、上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和環(huán)境應(yīng)激物等，將有助于探索脂代謝相關(guān)疾病的機(jī)制及治療研究。本研究擬構(gòu)建HSL 報告基因系統(tǒng)，并在293T 細(xì)胞中驗(yàn)證能否被已知上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ 激活。

1 材料與方法

1.1 材料

Universal Genomic DNA 提取試劑盒與Enzymatic Lysis Buffer 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，LA Taq DNA 聚合酶、Taq Mix、感受態(tài)細(xì)菌TRANS5α、瓊脂糖、EasyPure HiPure Plasmid Mini Prep Kit 試劑盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，KpnI、EcorV 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶和DL 2000 DNA Marker 購自日本TaKaRa 公司，PCR 引物和LB Broth 購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Luciferin 和熒光素酶報告基因pGL4.10-basic 購自美國Promega 公司，293T 細(xì)胞購自美國ATCC 公司，Lipofectamine 3000 試劑購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因組DNA 提取野生型C57BL/6 小鼠來自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。分離野生型C57BL/6小鼠棕色脂肪組織，后稱取10 mg，按基因組DNA 快速提取試劑盒（Universal Genomic DNA kit）說明書步驟提取小鼠基因組DNA。應(yīng)用Nanodrop 核酸分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 濃度及DNA 純度與完整性?；蚪MDNA 用于PCR 復(fù)制模板或置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成以小鼠HSL基因（NC_000073.6）及正向序列為目標(biāo)序列，應(yīng)用Primer Blast 在線服務(wù)程序設(shè)計(jì)引物：P1（含Kpn I 位點(diǎn)）正向5'-TGACGCGGTACCTCAGACTCATGGACGGGCAG GCAT-3'；P2（含Kpn I 位點(diǎn)）正向5'-TGACGCGGTA CCGCCACCCTCTCCCTTCATCAA-3'；共用P3（含Ecor V 位點(diǎn)）反向5'-GCTCTAGATATCTGGCACAGCAGG TCTGTGGCTAGT-3'；擴(kuò)增片段產(chǎn)物長度為3 086（P1與P3）和1 046 bp（P2 與P3）。上述引物由美國Life Technology 公司合成。

1.2.3 目的片段擴(kuò)增以小鼠基因組DNA 為模板，應(yīng)用P1 和P3 引物，擴(kuò)增HSL基因啟動子（-3 071 ～+ 15 bp）DNA 序列；應(yīng)用P2 和P3 引物，擴(kuò)增HSL基因啟動子（-1 031 ～+15 bp）DNA 序列。反應(yīng)體系：45 μlMix+1 μl primer（10 μmol/L）+4 μl DNA（300 ng）；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性120 s；94℃變性30 s；65℃退火30 s；68℃延伸1 min；循環(huán)25 次；68℃維持10 min。取10 μl PCR 產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠電泳（電壓100 V），紫外燈下觀察產(chǎn)物片段位置。從瓊脂糖凝膠中切出長度正確的PCR產(chǎn)物片段，回收、純化和保存PCR 產(chǎn)物。

1.2.4HSL基因啟動子報告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定應(yīng)用限制性內(nèi)切酶KpnI 和EcorV 分別酶切PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和空載體pGL4.10-basic 質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，回收和純化目的DNA 片段。應(yīng)用T4 DNA 連接酶連接帶有黏性末端的線性pGL4.10-basic DNA 和HSL基因啟動子片段，37℃孵育1 h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TRANS5α 感受態(tài)細(xì)菌中，于含氨芐霉素的LB 培養(yǎng)皿中篩選。16 h 后取單個陽性克隆菌落擴(kuò)增，用于酶切和測序驗(yàn)證。測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。命名重組載體為pGL4.10-basic-HSL。

1.2.5 pGL4.10-basic-HSL 轉(zhuǎn)錄活性檢測將293T細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)，在37℃、5%二氧化碳CO2條件下增殖至60%～80%時，應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑盒DNA 轉(zhuǎn)染，48 h 后按照熒光素酶檢測系統(tǒng)方法處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過Sunergy H1/H1 MD 系統(tǒng)測定熒光值。實(shí)驗(yàn)組每孔轉(zhuǎn)染40 ng pGL4.10-basic-HSL 和120 ng PPARγ 質(zhì)粒，對照組每孔轉(zhuǎn)染40 ng pGL4.10-basic-HSL 和120 ng Empty Vector 質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)組、對照組各6 孔平行樣，并重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSL 基因啟動子報告質(zhì)粒構(gòu)建成功

實(shí)驗(yàn)得到pGL4.10-basic-HSL-3K 和pGL4.10-basic-HSL-1K 質(zhì)粒。雙酶切兩質(zhì)粒，結(jié)果顯示插入片斷長度正確（見圖1A，4 和9 泳道；圖1B，7 和9 泳道）。進(jìn)一步測序結(jié)果顯示，克隆的小鼠HSL 基因啟動子序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中信息完全一致，提示重組載體pGL4.10-basic-HSL 插入片斷序列正確。

2.2 pGL4.10-basic-HSL 具有啟動子活性

與共轉(zhuǎn)染pGL4.10-basic-HSL 和Empty Vector比較，重組載體pGL4.10-basic-HSL（3 和1 K）和PPARγ共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，pGL4.10-basic-HSL 熒光素酶活性升高[-3 071 bp 為（24.71±2.80）倍，t=20.700，P=0.000；-1 031 bp 為（4.12±0.23）倍，t= 32.100，P=0.000]，提示構(gòu)建的pGL4.10-basic-HSL 具有啟動子活性（見圖2）。

圖1 雙酶切兩質(zhì)粒結(jié)果

圖2 質(zhì)粒螢光素酶活性比較

3 討論

脂肪依據(jù)分布、形態(tài)與功能，可分為白色脂肪、棕色脂肪以及米色脂肪。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)含單個大脂滴，多分布于皮下和臟器周圍，是機(jī)體的主要儲能場所；棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)含多個小脂滴，以消耗ATP 產(chǎn)熱為主要功能，多見于嬰幼兒，隨年齡增長不斷減少[8-11]。米色脂肪細(xì)胞的形態(tài)與功能介于白色與棕色脂肪細(xì)胞之間，常見于冷暴露后的脂肪組織中[8-11]。

白色脂肪是甘油三脂儲存和代謝的主要組織。脂肪分解是維持機(jī)體能量代謝穩(wěn)態(tài)的核心機(jī)制之一。HSL 作為甘油三酯分解的關(guān)鍵酶，在脂質(zhì)代謝過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。報道顯示，HSL 的缺失可造成嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝紊亂[12-14]，因而HSL 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究受到廣泛的關(guān)注。

HSL基因啟動子區(qū)域含有多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用生物信息學(xué)分析技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)HSL基因上游啟動子區(qū)域含有多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，有待未來驗(yàn)證。PPARγ 是已被確認(rèn)的能與HSL基因啟動子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子[7]。研究中也證實(shí)這一結(jié)論：當(dāng)啟動子區(qū)域未能覆蓋PPARγ 結(jié)合位點(diǎn)時（啟動子插入片段長度為1 kb），PPARγ 的激動效應(yīng)降低。

翻譯后修飾激活HSL。在脂解激素的作用下，細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP 水平迅速升高，繼而激活cAMP依賴的蛋白激酶A，后者磷酸化和活化HSL，最終參與脂解過程[5]。因此，HSL 的脂解功能取決于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控與磷酸化水平，可能還涉及其他的翻譯后修飾類型或降解水平等。因而，應(yīng)該結(jié)合多方面因素，綜合分析HSL 的脂解功能調(diào)控。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建HSL基因啟動子報告質(zhì)粒，為篩選誘導(dǎo)HSL轉(zhuǎn)錄表達(dá)的臨床用藥、小分子化合物、正向反式作用因子及環(huán)境應(yīng)激物提供基礎(chǔ)而高效的研究工具，將有助于深入研究HSL 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在代謝性疾病中的作用及潛在機(jī)制。