基于GC-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學的青皮揮發(fā)油防治阿爾茨海默癥的活性成分及作用機制研究

王騰華 羅穎懿 王馭辰 任之堯 唐建新 李詠梅 方翼 吳波

摘 要 目的：預測青皮揮發(fā)油防治阿爾茨海默?。ˋD）的主要活性成分和潛在作用靶點。方法：采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析青皮揮發(fā)油化學成分，并借助NIST 11.L數(shù)據(jù)庫和人工數(shù)據(jù)解析進行成分的結(jié)構(gòu)鑒定。借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）、PharmMapper數(shù)據(jù)庫等預測青皮揮發(fā)油活性成分及其對應靶點，借助GeneCards數(shù)據(jù)庫、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫等挖掘AD相關(guān)靶點;利用Venny 2.1.0軟件映射以獲取青皮揮發(fā)油防治AD的直接靶點;借助STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 7.2.1軟件挖掘核心節(jié)點，利用Venny 2.1.0軟件映射并去重后獲取青皮揮發(fā)油防治AD的間接靶點;借助DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫對上述直接和間接靶點（即作用靶點）進行基因本體（GO）功能富集和KEGG通路富集分析;采用Cytoscape 7.2.1軟件，以節(jié)點度值、介數(shù)中心度、緊密中心度為指標，對青皮揮發(fā)油“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，挖掘關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點。結(jié)果與結(jié)論：GC-MS法共分離并鑒定出青皮揮發(fā)油化學成分40個，均為活性成分，包括右旋檸檬烯、γ-萜品烯等。共挖掘出活性成分對應靶點151個、AD相關(guān)靶點1 291個，其中直接靶點48個、間接靶點41個。上述89個作用靶點主要富集于細胞分數(shù)、軸突、胞漿等細胞組分，細胞內(nèi)信號級聯(lián)、對有機物的反應等生物過程，蛋白激酶活性、胺受體活性等分子功能，以及癌癥通路、鈣信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路等信號通路（P<0.05）。共挖掘出α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇等關(guān)鍵成分10個，雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1等關(guān)鍵靶點21個，表明青皮揮發(fā)油防治AD呈多成分、多靶點、多通路的作用特點。

關(guān)鍵詞 青皮;揮發(fā)油;氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù);網(wǎng)絡(luò)藥理學;阿爾茨海默病;機制

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To predict the active components and potential target of volatile oil of Citri reticulatae preventing and treating Alzheimers disease （AD）. METHODS： The volatile oil of C. reticulatae was determined by GC-MS， and identified according to NIST 11.L database and manual data analysis. The active components and targets of volatile oil of C. reticulatae were predicted through TCMSP and PharmMapper database. The related targets of AD were obtained by using GeneCards and OMIM databases. Venny 2.1.0 software mapping was used to obtain the direct targets of volatile oil of C. reticulatae against AD. Core nodes were mined with STRING database and Cytoscape 7.2.1 software， and? the indirect targets of volatile oil of C. reticulatae against AD were obtained by mapping and duplication coith Venny 2.1.0 software. With the help of DAVID 6.7 database， the above direct and indirect targets （i.e. action targets） were used for gene ontology （GO） function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis. Using Cytoscape 7.2.1 software， topology analysis was conducted for the network of “active components-acting targets” of volatile oil of C. reticulatae， with node degree value， betweenness centrality and closeness centrality as indexes， then key components and key targets were mined. RESULTS & CONCLUSIONS： A total of 40 chemical components in volatile oil were identified by GC-MS， all of them were active components， including D-limonene， γ-terpinene， etc. A total of 151 active components-corresponding targets and 1 291 AD-related targets were mined， including 48 direct targets and 41 indirect targets. The above 89 targets were mainly concentrated in cell fraction， axon， cytosol and other cell components; intracellular signaling cascade， response to organic substance and other biological processes; protein kinase activity and amine receptor activity and other molecular functions; as well as cancer pathway， calcium signaling pathway and neurotrophin signaling pathway （P<0.05）. A total of 10 key components including α-terpinene， β-elemen， thymol and （-）-4-terpineol， as well as 21 key targets such as androgen receptor， prostaglandin G/H synthase 2， mitogen activated protein kinase 14， muscarinic acetylcholine receptor M1 were excavated， indicating the effect of volatile oil of C. reticulatae against AD had the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel.

KEYWORDS? ?Citri reticulatae; Volatile oil; GC-MS; Network pharmacology; Alzheimers disease; Mechanism

青皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮。其中，5～6月收集自落的幼果曬干者，習稱“個青皮”;7～8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣后曬干者，習稱“四花青皮”[1]。除橘類未成熟果實的果皮外，其同屬植物甜橙[C. sinensis（Linn.）Osbeck]、枸櫞（C. medica L.）以及茶枝柑（C. reticulata Blanco cv. Chachiensis）等柑類未成熟果實的果皮在有的地區(qū)亦作青皮使用[2]。青皮味辛、苦，性微溫，沉降下行，偏于疏肝膽氣分，有破氣行痰、消積化滯之功效[3]，對心腦血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)[4]及平滑肌[5]均具有廣泛的藥理作用，主要用于治療肝氣郁滯、疝氣、胸脅胃脘疼痛、食積、乳房脹痛、脘悶噯氣、久瘧癖塊等癥[6-7]。青皮揮發(fā)油為其主要藥效成分之一，具有理氣、調(diào)氣和抗菌等活性[8-10]。其中，D-檸檬烯是青皮發(fā)揮理氣作用的主要有效成分，同時還兼具祛痰、抗腫瘤[11-14]和廣譜抗菌[15]等作用;對傘花烴、芳樟醇、α-萜品醇以及檸檬醛等是青皮發(fā)揮調(diào)氣作用的主要成分[4]，且α-萜品醇還具有顯著的抗菌作用[16]。

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，也是老年癡呆中較常見的類型之一?，F(xiàn)有治療藥物的效果欠佳[17]，其中常用的乙酰膽堿酯酶抑制劑等化學藥物作用靶點單一，且長期服用會引發(fā)副作用和成癮性[18]。因此，多靶點抗AD研究已成為相關(guān)藥物研發(fā)的熱門方向[19]。中藥具有豐富的藥理活性，可通過多通路、多靶點發(fā)揮治療作用[4]。中藥揮發(fā)油是中藥材中一種具有揮發(fā)性的油狀液體，易透過血腦屏障并迅速入腦，具有藥理活性豐富、起效靶點多、不良反應較少且癥狀輕微等特點;同時，其獨特的芳香氣味容易讓患者接受并在治療過程中產(chǎn)生愉悅感[18]?？梢姡兴帗]發(fā)油在防治AD領(lǐng)域中可能具有較大潛力。已有研究顯示，羅勒揮發(fā)油可抗抑郁[20]，石菖蒲揮發(fā)油可抗焦慮[21]，辛夷、溫郁金揮發(fā)油可改善實驗動物的學習記憶能力[22-23]，當歸揮發(fā)油可提高記憶力、防治AD[24]等。有關(guān)青皮揮發(fā)油防治AD方面的研究主要集中于相關(guān)復方中，如：存注丹可緩解老年人健忘[25]，加味癲狂夢醒湯聯(lián)合鹽酸多奈哌齊可更有效地改善AD痰瘀互結(jié)證患者的中醫(yī)證候[26]?？紤]到中藥揮發(fā)油用于防治情志病具有一定的潛力，加之青皮也用于治療AD的中藥復方中，故本研究擬探索青皮揮發(fā)油防治AD的潛在靶點與途徑，為進一步闡明復方中單味藥的作用機制奠定基礎(chǔ)。

中藥具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點，其療效通常取決于其中有效成分群的綜合作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種藥物設(shè)計的新方法，涉及生物信息學、多向藥理學、計算機科學等多學科的技術(shù)和知識，可多方位地闡釋藥物治療疾病的潛在靶點及作用機制，體現(xiàn)了藥物作用的整體性和系統(tǒng)性，與中藥作用特點相一致[27-30]。為此，本研究通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對青皮揮發(fā)油中的活性成分進行定性分析，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究思路對所鑒定出的化學成分進行信息挖掘，篩選出青皮揮發(fā)油防治AD的關(guān)鍵活性成分、關(guān)鍵作用靶點以及潛在信號通路，旨在為青皮揮發(fā)油用于防治AD的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型GC-MS儀，配電子轟擊（EI）離子源以及5975C-GC/MSD數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Agilent公司）;TC-15型恒溫電熱套（海寧市新華醫(yī)療器械廠）;Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥材與試劑

青皮幼果采自江西省吉安市新干縣山湖鎮(zhèn)青皮種植基地，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥科學院黃志海教授鑒定為蕓香科植物橘（C. reticulata Blanco）的幼果。將其果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣，將所得果皮部分自然曬干后，即得四花青皮藥材。無水硫酸鈉、甲苯、石油醚（60～90 ℃）等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則中“2204揮發(fā)油測定法”項下“甲法”操作：稱取四花青皮藥材50 g，加10倍量（mL/g）水，浸泡2 h，回流提取9 h，得黃色透明液體，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，即得青皮揮發(fā)油。平行操作3次。每克藥材可得揮發(fā)油（1.367±0.058） mL。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC條件 色譜柱：HP-5MS 5 Phenyl-Methyl Siloxane石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）;升溫程序（初始溫度50.00 ℃，以0.40 ℃/min升至55.92 ℃，以0.20 ℃/min升至58.00 ℃，再以15.00 ℃/min升至88.00 ℃并保持2.00 min;以1.30 ℃/min升至131.70 ℃，以0.80 ℃/min升至137.00 ℃，再以1.50 ℃/min升至148.00 ℃并保持2.00 min;以15.00 ℃/min升至248.00 ℃，以20.00 ℃/min升至280.00 ℃?？傔\行時間：87.04 min）;進樣口溫度：250 ℃;氣化室溫度：250 ℃;載氣（氦氣）流速：1.0 mL/min;進樣量：1.0 μL;進樣方式：分流進樣，分流比：10 ∶ 1。

2.2.2 MS條件 離子源：EI離子源;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：150 ℃;電子轟擊能量：70 eV;溶劑延遲：3 min;掃描范圍：m/z 50～500。

2.2.3 青皮揮發(fā)油成分分析 取“2.1”項下青皮揮發(fā)油，用適量石油醚溶解后，按“2.2.1”“2.2.2”項下GC-MS條件進樣分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過NIST 11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索、匹配后，經(jīng)人工解析并確定各化學成分的結(jié)構(gòu)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

2.3.1 青皮揮發(fā)油活性成分的篩選 將“2.2.3”項下已鑒定出的青皮揮發(fā)油成分輸入至中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.du.cn/tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件[31]對青皮揮發(fā)油活性成分進行篩選。

2.3.2 青皮揮發(fā)油對應靶點的收集 將“2.3.1”項所得青皮揮發(fā)油活性成分錄入TCMSP和PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），限定物種為“人類（Homo sapiens）”。將檢索所得各靶點以反向?qū)咏Y(jié)合值（即Fit值）降序排列，選擇前20位作為每個成分對應的主要靶點[32]。將上述主要靶點錄入UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，檢索相應的UniProt ID，并獲取對應的基因簡稱（Gene symbol），去重后即得青皮揮發(fā)油活性成分的對應靶點。

2.3.3 AD相關(guān)靶點的收集 以“Alzheimers disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）中檢索AD相關(guān)靶點。其中，GeneCards數(shù)據(jù)庫中以相關(guān)分數(shù)（Relevance score）>10為標準[33]進行篩選。將兩個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果去重后，即得AD相關(guān)靶點。

2.3.4 青皮揮發(fā)油防治AD直接靶點的收集 利用Venny 2.1.0軟件映射“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發(fā)油活性成分對應靶點和AD相關(guān)靶點，即得青皮揮發(fā)油防治AD的直接靶點。

2.3.5 青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點的確定 為明確青皮揮發(fā)油成分靶點與疾病AD靶點之間的相互作用關(guān)系，將“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發(fā)油活性成分對應靶點和AD相關(guān)靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，設(shè)置較高置信度（High confidence）≥0.700[34]，除去未相互連接的節(jié)點（Node）后，得“靶點互作”網(wǎng)絡(luò)并保存為“tsv”格式文件;將上述文件導入Cytoscape 7.2.1軟件，運用軟件中的“CentiScaPe 2.2”插件計算節(jié)點度值（Degree），選取度值大于平均度值2倍的靶點作為核心節(jié)點（Hub node）[35]。利用Venny 2.1.0軟件將該核心靶點與“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發(fā)油活性成分對應靶點和AD相關(guān)靶點進行映射，選擇與活性成分對應靶點的交集靶點，在排除與“2.3.4”項下直接靶點重復的靶點之后，即得青皮揮發(fā)油防治AD的間接靶點。將直接靶點與間接靶點合并，即得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點。

2.3.6 基因本體（GO）功能和KEGG通路富集分析 將“2.3.5”項下所得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點錄入DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫（https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05為顯著富集，且P值越小則顯著性程度越高[36]。將P值由小到大排序，取前10位利用GraphGad Prinsm 7軟件繪制GO功能富集柱狀圖（即二級分類柱狀圖，包括細胞組分、分子功能、生物過程）;將P值由小到大排序，利用OmicShare在線工具（http：//www.omicshare.com/）繪制KEGG通路富集氣泡圖。

2.3.7 關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點的篩選 將“2.3.5”項下所得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點及相應活性成分通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建青皮揮發(fā)油的“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，并運用軟件中“CentiScaPe 2.2”插件進行拓撲學分析，計算節(jié)點度值、介數(shù)中心度（Betweenness centrality）和緊密中心度（Closeness centrality），并選擇上述參數(shù)均大于其對應均值的成分和靶點作為青皮揮發(fā)油抗AD的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點[35]，再通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)，進行可視化展示。

3 結(jié)果

3.1 青皮揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

青皮揮發(fā)油GC-MS總離子流圖見圖1。經(jīng)NIST 11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索、匹配和人工解析后，共鑒定出40個成分（匹配度均大于80%），大多為萜烯類、不飽和醇類、酯類、長鏈烷烴類以及苯類化合物，如右旋檸檬烯、 γ-萜品烯、芳樟醇、β-月桂烯等，詳見表1。

3.2 青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點的篩選結(jié)果

表1中，所有化學成分的OB值均大于30%;除（-）-4-萜品醇的DL值為0.11外，其余化學成分的DL值均大于0.18?？紤]到（-）-4-萜品醇對情志病具有一定的治療作用[37-38]，故本研究將包含其在內(nèi)的40個化學成分作為活性成分全部導入TCMSP和PharmMapper數(shù)據(jù)庫，并分別收集到273、760個靶點;經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫校正、去重后得到青皮揮發(fā)油活性成分對應靶點151個。以“Alzheimers disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中共收集到AD相關(guān)靶點1 291個。經(jīng)Venny 2.1.0軟件映射后，共得到青皮揮發(fā)油防治AD直接靶點48個。

利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytospace 3.7.1軟件共篩選出大于平均度值（21.866）2倍的核心節(jié)點401個（“靶點互作”網(wǎng)絡(luò)圖略）;經(jīng)Venny 2.1.0軟件映射后，共得到間接靶點41個。將直接靶點和間接靶點合并，即得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點89個，詳見圖2。

3.3 GO功能富集和KEGG通路富集結(jié)果

GO功能富集結(jié)果顯示，89個作用靶點主要涉及GO功能過程564個（P<0.05）。其中，生物過程富集440個，以有機物的反應（Response to organic substance）、對內(nèi)生刺激的反應（Response to endogenous stimulus）、細胞內(nèi)信號級聯(lián)（Intracellular signaling cascade）等為主;細胞組分富集43個，以細胞分數(shù)（Cell fraction）、軸突（Axon）、胞漿（Cytosol）、不溶性組分（Insoluble fraction）等為主;分子功能富集81個，以胺受體活性（Amine receptor activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、胺結(jié)合（Amine binding）、腎上腺素受體活性（Adrenoceptor activity）等為主，詳見圖3。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，89個作用靶點主要富集于19條通路上（P<0.05），以癌癥通路（Pathways in cancer）、局灶性粘連（Focal adhesion）、結(jié)直腸癌（Colorectal cancer）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路（Neurotrophin signaling pathway）等為主，詳見圖4。

3.4 青皮揮發(fā)油防治AD關(guān)鍵成分及關(guān)鍵靶點的篩選結(jié)果

“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖略）中，介數(shù)中心度、緊密中心度和節(jié)點度值均大于其對應平均值（上述參數(shù)的平均值分別為456.201 7、0.003 130、14.900）的關(guān)鍵成分有10個，分別為α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇、右旋檸檬烯、乙酸橙花酯、香葉醇、Cis-2，8-menthadien-1-ol、β-松油醇、Cis-carveol，節(jié)點度值分別為31.000、27.000、26.000、25.000、21.000、19.000、19.000、17.000、17.000、17.000。其中，α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇的節(jié)點度遠高于其他成分。

介數(shù)中心度、緊密中心度和節(jié)點度值均大于其對應平均值（上述參數(shù)的平均值分別為134.561 8、0.002 679、6.700）的關(guān)鍵靶點有21個，分別為血清白蛋白（ALB）、載脂蛋白A-Ⅱ（APOA2）、胱天蛋白酶7（CASP7）、碳酸酐酶2（CA2）、維生素D結(jié)合蛋白（GC）、類驅(qū)動蛋白KIF11（KIF11）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）、β-分泌酶1（BACE1）、鈉依賴性多巴胺轉(zhuǎn)運體（SLC6A3）、雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、凝血酶原（F2）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（CHRM1）、γ-氨基丁酸受體α-2亞單位（GABRA2）、CHRM2、二肽基肽酶4（DPP4）、絲裂原活化蛋白激酶10（MAPK10）、孕酮受體（PGR）、MAPK8、CHRM3，節(jié)點度值分別為34.000、27.000、24.000、22.000、21.000、21.000、20.000、17.000、16.000、16.000、16.000、15.000、14.000、14.000、13.000、13.000、12.000、12.000、10.000、10.000、9.000。其中，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3富集于“3.3”項下所得的19條KEGG通路上。青皮揮發(fā)油防治AD的“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖5。

4 討論

本研究結(jié)合GC-MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，初步探討了青皮揮發(fā)油防治AD的潛在活性成分以及分子作用機制。通過GC-MS分析，共鑒定出匹配度較高的活性成分40個;通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫和軟件映射后，共得到青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點89個。

GO富集結(jié)果顯示，89個作用靶點主要分布于564個GO功能過程。筆者結(jié)合AD的發(fā)病機制分析發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶可通過抑制Tau蛋白的過度磷酸化而保護神經(jīng)元[39];突觸的胞外信號可引起胞內(nèi)信號級聯(lián)，并參與調(diào)節(jié)基因功能[40]，均與AD發(fā)生有關(guān)。本研究GO富集結(jié)果顯示，89個作用靶點主要富集于蛋白激酶活性、細胞內(nèi)信號級聯(lián)等生物過程及分子功能，與上述研究基本一致，提示青皮揮發(fā)油可能通過上述途徑防治AD。有研究指出，鈣離子濃度過高，可激活蛋白激酶，從而引起Tau蛋白的過度磷酸化;鈣離子濃度過低，則會導致依賴鈣的相關(guān)酶活性降低，造成β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積[41];鈣離子失調(diào)還會引起活性氧等下游物質(zhì)含量升高，誘發(fā)體內(nèi)氧化應激，最終導致神經(jīng)元凋亡[42-43]。神經(jīng)營養(yǎng)素是神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)，也是與神經(jīng)細胞存活相關(guān)的生長因子，其家族成員之一的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子主要分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與學習以及記憶能力密切相關(guān)[44-45]。此外，徐倩等[27]通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，AD的差異表達基因主要富集于癌癥通路，還涉及結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌等通路。本研究KEGG富集結(jié)果顯示，89個作用靶點主要富集于鈣信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路以及癌癥通路等信號通路上，提示青皮揮發(fā)油可能通過上述通路發(fā)揮對AD的防治作用。此外，局灶性粘連、結(jié)直腸癌等癌癥通路也可作為青皮揮發(fā)油防治AD的潛在靶點，但具體機制有待后續(xù)深入研究。

通過對“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，共篩選出關(guān)鍵成分10個。在篩選出的10個關(guān)鍵成分中，右旋檸檬烯是青皮揮發(fā)油測定結(jié)果中峰面積最大的活性成分，且匹配度達99%;γ-萜品烯作為青皮揮發(fā)油測定結(jié)果中峰面積第二大的成分，有研究指出其與百里酚聯(lián)用后可增強乙酰膽堿水平及煙堿型乙酰膽堿的反應性[46]。α-萜品烯為“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值最高的成分，具有很好的抗氧化活性，并可有效抑制脂氧合酶和乙酰膽堿酯酶的活性[47]。有研究指出，百里酚對Aβ致海馬突觸損傷的高脂模型大鼠具有一定的保護和治療作用[48-49]。（-）-4-萜品醇可通過抑制丁酰膽堿酯酶的活性來發(fā)揮對AD的治療作用[37];且有研究顯示，富含（-）-4-萜品醇的朝鮮冷杉揮發(fā)油可有效提高莨菪堿誘導的健忘模型大鼠的記憶力[38]。由此可見，青皮揮發(fā)油在防治AD方面具有較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過對“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，共篩選出關(guān)鍵靶點21個。目前，AD的發(fā)病機理雖未完全明確，但現(xiàn)代醫(yī)學普遍認為，AD的發(fā)生與Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應、膽堿能、物質(zhì)能量代謝等因素有關(guān)[50-51]。在篩選出的21個關(guān)鍵靶點中，ALB的節(jié)點度值最高，亦遠高于其余節(jié)點。有研究發(fā)現(xiàn)，ALB可有效抑制Aβ的聚集，從而緩解AD癥狀[52]。本研究還發(fā)現(xiàn)，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3等9個作用靶點富集于19條KEGG通路上。CHR廣泛存在于大腦中，其中CHRM1可緩解Aβ所致的興奮性神經(jīng)毒性，并緩解AD模型小鼠的認知障礙[53-54];CHRM2與智力、人格特征以及抑郁等有關(guān)[55]，均是AD治療的潛在靶點。MAPK14與炎癥反應的發(fā)生密切相關(guān)，且其表達量在AD模型大鼠體內(nèi)明顯升高[56]，亦可能成為治療AD的作用靶點之一。PTGS2已被初步證實為杜仲植物雌激素類成分治療AD[57]以及酸棗仁湯治療失眠[58]的主要靶點之一。孕酮是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)元載體，不僅對生殖系統(tǒng)具有重要意義，而且還可通過提高神經(jīng)元存活率、抑制炎癥反應、改善腦缺血和腦損傷等途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能[59-60]，但關(guān)于孕酮及其受體發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制尚不完全清楚，有待后續(xù)研究予以證實。

綜上所述，本研究借助GC-MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，初步篩選了青皮揮發(fā)油防治AD的活性成分及潛在作用靶點，為中藥揮發(fā)油防治AD等情志類疾病的研究以及后續(xù)實驗評價指標的篩選等提供了思路與理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-02-07 修回日期：2020-07-07）

（編輯：張元媛）