高-低氧雙向誘導(dǎo)制備新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良并發(fā)肺動脈高壓模型

邢玉嬌，衣曼，富建華，薛辛東

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院兒內(nèi)科，沈陽 110004；2.加拿大曼尼托巴大學(xué)兒童醫(yī)院研究所生理系，Winnipeg R3E 3P4）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）常見于早產(chǎn)兒，是一種慢性肺損傷疾病，在接受呼吸支持治療和氧暴露的超低出生體重兒（extremely low birth weight，ELBW）中，BPD發(fā)病率高達(dá)60%～83%，由于該病缺乏有效的防治手段，目前已經(jīng)成為在兒童醫(yī)療費(fèi)用消耗中僅次于哮喘的第二大疾病［1］。BPD的主要病理變化為肺泡發(fā)育障礙和肺微血管的發(fā)育不良，以往研究［2-5］多集中于BPD的肺泡發(fā)育障礙，近年來發(fā)現(xiàn)，BPD患兒合并肺動脈高 壓（pulmonary hypertension，PH）高 達(dá)25%～40%，BPD-PH患兒不僅死亡率高達(dá)14%～38%，存活患兒的生存質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯考膊“l(fā)生機(jī)制及治療方法的基礎(chǔ)，目前臨床有關(guān)早產(chǎn)兒BPD的模型制備包括吸入高濃度氧氣、機(jī)械通氣、LPS誘導(dǎo)等，而其中最經(jīng)典、最常用為高濃度氧（30%～100%）制備［6］，該模型雖然在臨床過程和病理改變上符合早產(chǎn)兒BPD，但缺乏PH的病理改變，故探討加用短暫低氧刺激來模擬臨床早產(chǎn)兒生后短暫血氧飽和度下降，有助于更好研究BPD-PH疾病的發(fā)生機(jī)制。本研究采用60%～13%高-低氧雙向誘導(dǎo)方法建立模型，并通過影像學(xué)、組織學(xué)證實(shí)所建模型符合臨床BPD-PH患兒表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

足月新生Sprague-Dawley大鼠，由曼尼托巴大學(xué)兒童醫(yī)院研究所動物中心提供。

1.2 分組

將大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分組飼養(yǎng)于不同氧濃度的玻璃箱內(nèi)。

1.3 模型制備方法

空氣組（A組），飼養(yǎng)于21% O2環(huán)境，BPD組（H組）飼養(yǎng)于60% O2環(huán)境，低氧組（AL組）每日23 h置于21% O2環(huán)境，1 h置于13% O2環(huán)境，BPD-PH組（HL組）每日23 h置于60% O2，1 h置于13% O2環(huán)境，A組與AL組作為對照，每日分別與H組和HL組母鼠進(jìn)行交換，以保證母鼠的哺乳能力及防止氧中毒。各組按不同條件持續(xù)飼養(yǎng)至生后14 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

1.4.1 主要儀器：動物氧箱（美國BioSpherix ProOx P110高/低氧可控氧箱），水浴箱（Thermo ScientificTMPrecisionTMwater baths），切片機(jī)（ShandonTMFinesseTM325 Manual Microtome），過缸機(jī)（Leica TP1020 半自動臺式組織脫水機(jī)），包埋機(jī)（Shandon HistoCentre 2 Embedding Center），光學(xué)顯微鏡（ZEISS Axio Lab A1；AxioCam 105 color成像系統(tǒng)），60℃烤箱（Techne HB-1D Hybridiser Hybridisation Oven/Incubator），心臟超聲儀［Vevo 2100 High Resolution Imaging System（Visualsonics，Canada）］，肺功能儀［Flexi-Vent Small Animal Ventilator（Scireq，Canada）］，搖床（Lab-Line Model 4631 Maxi Rotator），電子秤［TR-8102D Toploading Balances（大），METTLER TOLEDO AL104 Analytical Balance（?。荨?/p>

1.4.2 主要試劑：HE染色試劑購自美國Sigma公司，免疫組化試劑購自美國Vector Laboratories公司，彈性蛋白染色試劑購自美國Rowley Biochemical公司，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Sigma A2547，Mouse monoclonal Anti-α Smooth Muscle Actin）。

1.5 功能測定

1.5.1 二維超聲心動圖和多普勒檢查：分別于生后7 d和14 d對各組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量稱量，應(yīng)用vevo 2100高分辨成像系統(tǒng)（VisualSonics，Toronto canada），40 MHz探頭（MS 550D）進(jìn)行超聲心動圖檢查以評價(jià)肺血流動力學(xué)。異氟烷吸入麻醉誘導(dǎo)后，將大鼠仰臥位置于加熱的ECG板上，保持體溫并獲得心電圖數(shù)據(jù)，同時(shí)面罩持續(xù)給予適當(dāng)濃度O2和異氟烷吸入維持麻醉狀態(tài)。將探頭溫和置于胸部，在胸骨旁主動脈根部短軸切面肺動脈瓣口處測量肺動脈加速時(shí)間（pulmonary arterial acceleration time，PAAT）和右心室射血時(shí)間（right ventricular ejection time，RVET）。PAAT為從肺動脈收縮開始到達(dá)到流出速度峰值的時(shí)間，RVET為從肺動脈射血開始到完成收縮期的時(shí)間。

1.5.2 肺功能測定：應(yīng)用flexi-Vent小動物呼吸機(jī)（Scireq，Montreal，Quebec）測定14 d大鼠肺功能［7］。大鼠接受90 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射。建立麻醉后，行頸正中氣管切開術(shù)，并在氣管內(nèi)插入聚乙烯導(dǎo)管（1.1 mm×25 mm），用外科縫線固定導(dǎo)管位置。導(dǎo)管另一端連接到小動物呼吸機(jī)，呼氣末正壓（positive end-expiratory pressure，PEEP）維持在3 cmH2O。呼吸機(jī)根據(jù)大鼠體質(zhì)量向大鼠肺部傳送10 mL/kg的潮氣量，呼吸頻率150次/min。大鼠通過導(dǎo)管接受不同濃度的醋甲膽堿（35 μL，3～50 mg/mL，配制成生理鹽水溶液）激發(fā)，收縮氣道平滑肌以放大模型效果，進(jìn)行肺功能測定，基礎(chǔ)肺功能測定則僅使用等量生理鹽水。每次激發(fā)前，肺載氣量由總肺活量校準(zhǔn)。使用機(jī)器預(yù)設(shè)的flexiVent Prime-3低頻強(qiáng)制振蕩程序獲得呼吸機(jī)械輸入阻抗，機(jī)器測得參數(shù)后通過阻抗校準(zhǔn)，輸出肺氣道阻力，肺組織阻力和肺組織總體彈性等結(jié)果。

1.6 動物組織標(biāo)本檢測指標(biāo)

1.6.1 標(biāo)本的留取及組織切片制備：生后14 d大鼠接受肺功能測定后，打開胸腔，剪開左心耳，用無菌輸液針刺入右心室，4 ℃ PBS溶液以18 cm H2O壓力進(jìn)行灌洗，直至肺循環(huán)血液灌出。將左肺葉浸泡于4% PFA中固定72 h。心臟減去心房和游離大血管，沿室間隔剪下右心室壁，分別稱量右心室及左心室+室間隔的質(zhì)量，計(jì)算右心室質(zhì)量/（左心室質(zhì)量+室間隔質(zhì)量）［right ventricular/（left ventricle+ventricle septum），RV/（LV+VS）］比值。

組織浸泡于4% PFA中固 定72 h后，用Leica TP1020 半自動臺式組織脫水機(jī)，順序浸泡于70% 乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，二甲苯，60℃石蠟進(jìn)行脫水，應(yīng)用Shandon HistoCentre 2 Embedding Center包埋機(jī)對脫水后的組織進(jìn)行石蠟包埋，制作蠟塊。應(yīng)用ShandonTMFinesseTM325 Manual Microtome切片機(jī)，制作5 μm 組織切片。

1.6.2 HE染色及輻射狀肺泡計(jì)數(shù)（radical alveolar counts，RAC）值計(jì)數(shù)：切片脫蠟水化，應(yīng)用蘇木素（Sigma HHS 16-500 mL）及 伊 紅（Sigma HT110116-500 mL）對切片進(jìn)行HE染色，封片干燥后由光學(xué)顯微鏡200×采集圖像，每張切片選取10個(gè)視野，應(yīng)用Emery和Mithal的方法［8］計(jì)數(shù)RAC值，并進(jìn)行組間比較。

1.6.3 α-SMA免疫組化染色：組織切片脫蠟水化后浸泡于PBS中：檸檬酸鹽緩沖液煮沸30 min，室溫冷卻20 min，Avidin封閉液（Vector sp-2001）及Biotin封閉液（Vector wp-2001）封閉后4 ℃過夜孵育一抗：α-SMA（Sigma A2547，mouse monoclonal Anti-α Smooth Muscle Actin；1 ∶800封閉液稀釋）次日孵育二抗：驢抗小鼠，1 ∶400封閉液稀釋，DAB法顯色（Thermo Scientific-34002），蘇木素（Vector H-3404）復(fù)染，脫水，封片，干燥后光學(xué)顯微鏡200×采集圖像。

1.6.4 彈性蛋白特殊染色：Hart’s 彈性蛋白染色法（染劑購自Rowley Biochemical，F(xiàn)-397）對切片進(jìn)行染色，分別經(jīng)過0.25%高錳酸鉀水溶液（F-379-3）氧化，雷鎖辛-品紅（F-397-1）工作液初染，5%草酸水溶液（F-397-4）洗片，Van Gieson’s溶液（F-397-2）復(fù)染后，脫水，封片干燥后光學(xué)顯微鏡（200×）采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺動脈壓力改變

各組大鼠生后14 d測定PAAT和RVET，A組、AL組、H組間RVET、PAAT及RVET/PAAT無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HL組相較于A組，RVET延長但不顯著，PAAT明顯縮短（P＜0.05），RVET/PAAT明顯升高（P＜0.001）。見圖1、表1。

Fig.1 Two-dimensional echocardiography and doppler examination on 14 d after birth圖1 各組大鼠生后14 d二維心臟超聲多普勒結(jié)果

表1 各組RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.1 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of each group（，n=12）

表1 各組RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.1 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of each group（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A.

分別測定生后7 d 時(shí)A組與HL組大鼠PAAT和RVET，并與生后14 d比較（圖2、表2），7 d 時(shí)HL組與A組各項(xiàng)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，14 d 時(shí)PAAT及RVET/PAAT出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 肺功能改變

圖2 A組和HL組大鼠生后7 d和14 d二維心臟超聲多普勒對比Fig.2 Comparison between HL and A groups using two-dimensional echocardiography and doppler findings from examination on 7 d and 14 d after birth

表2 生后7 d和14 d時(shí)A組與HL組間RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.2 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of group A and group HL on 7 d and 14 d after birth（，n=12）

表2 生后7 d和14 d時(shí)A組與HL組間RVET、PAAT及RVET/PAAT比值（，n=12）Tab.2 RVET，PAAT，and RVET/PAAT ratios of group A and group HL on 7 d and 14 d after birth（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A14 d.

各組肺氣道阻力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HL組肺組織阻力較A組高，從Mch 12 mg/mL刺激時(shí)開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨著Mch計(jì)量增加差異更加明顯（P＜0.01）。HL組織彈性阻力從Mch 25 mg/mL刺激開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。H組，AL組與A組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖3。

2.3 新生大鼠BPD-PH模型的大體變化

圖3 各組大鼠肺功能變化Fig.3 Change in the lung function in each group

表3 各組大鼠生后14 d體質(zhì)量及大鼠心臟RV/（LV+S）比值（，n=12）Tab.3 Rat body weight and RV/（LV+S）ratio of each group on 14 d after birth（，n=12）

表3 各組大鼠生后14 d體質(zhì)量及大鼠心臟RV/（LV+S）比值（，n=12）Tab.3 Rat body weight and RV/（LV+S）ratio of each group on 14 d after birth（，n=12）

1）P＜0.05，2）P＜0.001 compared with group A；3）P＜0.001 compaed with group H.

各組大鼠在生后14 d 時(shí)體質(zhì)量情況（表3），A組與AL組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，H組與A組相比體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05），HL組體質(zhì)量與A組相比，差異更加顯著（P＜0.001），HL組與H組相比，體質(zhì)量也顯著下降（P＜0.001）。RV/（LV+S）比值（表3），HL組較A組顯著增高（P＜0.001），提示發(fā)生右心室肥厚，AL組，H組與A組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 肺組織形態(tài)學(xué)改變（圖4）

肺組織切片HE染色后可見A組和AL組為肺泡正常發(fā)育。H組肺泡體積變大，次級分隔減少，肺間質(zhì)堆積增厚，HL組表現(xiàn)較H組更為嚴(yán)重：肺泡數(shù)量明顯下降，肺泡大而結(jié)構(gòu)簡單，次級分隔少。

各組HE切片進(jìn)行RAC值計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，A組為9.45±0.78，AL組 為9.75±0.88，H組 為7.475±1.19，HL組為6±1.68，A組與AL組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，H組較A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），RAC值明顯降低，HL組與A組比較RAC值進(jìn)一步降低，差異更為顯著（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠肺組織切片HE染色 ×200Fig.4 HE staining of lung sections of the groups ×200

2.5 α-SMA表達(dá)變化

將各組肺組織切片進(jìn)行α-SMA免疫組織化學(xué)染色（圖5），A組可見染成棕色的α-SMA于次級分隔即將形成處濃聚（紅色箭頭標(biāo)出），肺血管壁α-SMA分布菲?。S色箭頭標(biāo)出）。AL組表現(xiàn)與A組大致相同。H組可見肺泡次級分隔減少，次級分隔積聚的α-SMA也減少，但有α-SMA呈線性分布于沒有形成次級分隔的肺泡壁（紅色箭頭標(biāo)出），血管壁染色較A組增多（黃色箭頭標(biāo)出）。HL組表現(xiàn)較H組更加明顯，且肺血管腔直徑增大。

2.6 Elastin表達(dá)變化

圖5 各組大鼠肺組織切片α-SMA免疫組織化學(xué)染色 ×200Fig.5 Immunohistochemical staining of α-SMA in lung sections of the groups ×200

根據(jù)Hart’s 彈性蛋白染色法對各組肺組織切片進(jìn)行特殊染色（圖6）。A組可見染成黑色的Elastin于次級分隔即將形成處呈點(diǎn)狀濃聚（紅色箭頭標(biāo)出），肺血管壁Elastin分布菲薄（藍(lán)色箭頭標(biāo)出）。AL組表現(xiàn)與A組大致相同。H組可見肺泡次級分隔減少，次級分隔積聚的Elastin也減少，有些濃聚處散亂如毛刷，但有Elastin呈線性分布于沒有形成次級分隔的肺泡壁（紅色箭頭標(biāo)出），血管壁染色較A組增多（藍(lán)色箭頭標(biāo)出）。HL組表現(xiàn)較H組更加明顯，且肺血管腔直徑增大。

3 討論

自從上世紀(jì)Northway提出BPD至今已50余年，隨著早產(chǎn)兒救治技術(shù)提高，生存率亦隨之提高，BPD的定義在幾十年間被逐漸修改完善。早產(chǎn)兒BPD的病因多種多樣，包括產(chǎn)前宮內(nèi)發(fā)育遲緩，胎盤功能不良，絨毛膜羊膜炎，細(xì)菌感染，孕母高血壓/子癇前期，孕母吸煙/濫用藥物，遺傳因素等，以及生后接受機(jī)械通氣，氧療，感染，動脈導(dǎo)管開放，營養(yǎng)不良等因素［9］。

嚙齒動物和人類的肺發(fā)育分為5個(gè)階段：胚胎期，假腺管期，微管期，囊泡期，肺泡期。足月新生大鼠出生時(shí)肺處于囊泡期，類似于人類胎齡26～28周的早產(chǎn)兒［10］，因此大鼠模型被廣泛應(yīng)用于BPD研究。目前，研究中常見構(gòu)建動物BPD研究模型方法包括高氧、機(jī)械通氣、LPS誘導(dǎo)等，其中最常用的BPD動物模型建立方法為新生大鼠或小鼠，暴露于一定濃度的氧氣，持續(xù)幾天或幾周［6］。隨著新生兒氧療的日漸規(guī)范，以往研究者建立動物模型應(yīng)用的高濃度氧（75%［11］、85%［12］、95%［13］、100%［14］）條件，目前在臨床已不多見。大鼠造模的優(yōu)點(diǎn)在于繁殖快，廉價(jià)。高濃度氧氣使新生大鼠肺囊泡分隔形成肺泡的過程延遲，肺間質(zhì)增厚，持續(xù)炎癥反應(yīng)，遠(yuǎn)端微血管發(fā)育不良［15］。這些表現(xiàn)與臨床上早產(chǎn)兒BPD類似［16］。高氧模型簡便易得，且能還原BPD的主要病理生理特點(diǎn)。

圖6 各組大鼠肺組織切片Hart’s染色 ×200Fig.6 Hart’s staining of elastin in lung sections of the groups ×200

臨床上已發(fā)現(xiàn)BPD患兒合并PH的幾率高達(dá)25%～40%，雖然長期接受氧療及機(jī)械通氣，中樞神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)發(fā)育的不完善，仍使早產(chǎn)兒存在血氧飽和度下降的情況，目前關(guān)于PH的動物研究模型中，低氧為主要造模手段。前期研究［17-24］發(fā)現(xiàn)，新生大鼠暴露于60%O214 d，大鼠出現(xiàn)肺發(fā)育停滯。肺泡數(shù)減少，肺泡體積增大，肺間質(zhì)增厚，即表現(xiàn)出早產(chǎn)兒BPD的相關(guān)特點(diǎn)，但并未出現(xiàn)PH，因此，本研究設(shè)想，在經(jīng)典的BPD造模方法（生后長期吸入高濃度氧氣）的基礎(chǔ)上，增加短時(shí)低氧刺激，以模擬臨床中早產(chǎn)兒因缺氧致血氧飽和度下降的事件，建立BPD-PH模型。

本研究中，模型組新生大鼠每日吸入60% O223 h，13% O21 h，連續(xù)14 d后進(jìn)行心臟超聲檢測，發(fā)現(xiàn)RVET/ PAAT值明顯升高，間接說明PH出現(xiàn)。肺功能測定發(fā)現(xiàn)HL組組織阻力及彈性阻力顯著升高。肺組織切片HE染色，RAC值測定反映模型組出現(xiàn)BPD典型病理改變。表現(xiàn)出肺泡數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)簡單，次級分隔數(shù)量減少等肺發(fā)育停滯特點(diǎn)。肺泡次級分隔形成的關(guān)鍵成分α-SMA及彈性蛋白表達(dá)及分布均發(fā)生改變。以上結(jié)果說明，應(yīng)用60%～13%高-低氧雙向誘導(dǎo)方法建立模型，不僅肺組織的病理變化符合經(jīng)典BPD模型表現(xiàn)，而且通過心臟超聲和肺功能驗(yàn)證，模型同時(shí)形成了PH，存在肺功能受累，與經(jīng)典的模型相比，更貼近臨床早產(chǎn)兒BPD并發(fā)PH的表現(xiàn)，故更適用于該疾病相關(guān)研究。

綜上，本研究應(yīng)用高-低氧雙向誘導(dǎo)建立BPDPH模型，經(jīng)鑒定模型存在BPD及PH的典型表現(xiàn)，可以用于今后早產(chǎn)兒BPD-PH的相關(guān)研究。