氟伐他汀鈉對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT/mTOR通路的影響

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng) 110001）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是世界上第二常見(jiàn)的皮膚癌，發(fā)病率不斷升高［1］。近年來(lái)，我國(guó)CSCC的發(fā)病率也逐年升高，發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。CSCC嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來(lái)了沉重的身心負(fù)擔(dān)［2］。他汀類是治療中老年人群高脂血癥的常用藥物。近年來(lái)，隨著他汀類藥物的廣泛應(yīng)用和對(duì)其作用機(jī)制的深入研究，其抗腫瘤的作用受到廣泛關(guān)注［3-4］。在肺癌［5］、肝癌［6］、結(jié)直腸癌［7］、乳腺癌［8］等方面相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展，但他汀類藥物在皮膚腫瘤方面的研究國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究以培養(yǎng)的人CSCC SCL-1細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察氟伐他汀鈉對(duì)SCL-1細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人CSCC細(xì)胞株 SCL-1由德國(guó)柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng)。主要試劑包括氟伐他汀鈉（上海源葉生物科技有限公司）、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）、胎牛血清（美國(guó)Bioscience公司）、噻唑藍(lán)（北京索萊寶公司）、二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司）、Annexin V/PI凋亡試劑盒（上海優(yōu)寧維有限公司）、Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo公司）、實(shí)時(shí)qPCR試劑盒（日本Toyobo公司）。

1.2 方法

1.2.1 氟伐他汀鈉儲(chǔ)存液及工作液配制：用DMSO將氟伐他汀鈉充分溶解，配制成800 μmol/L濃度的母液（DMSO 終濃度≤0.01%），22 μm濾器過(guò)濾，4 ℃避光保存；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成含氟伐他汀鈉10、20、50、100 μmol/L的工作液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：將 SCL-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。觀察培養(yǎng)基清亮，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)良好，細(xì)胞鋪滿瓶壁 70%～80%可以傳代。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCL-1細(xì)胞，以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸去96孔板中的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入10、20、50、100 μmol/L工作液；設(shè)空白組（只加入培養(yǎng)液無(wú)細(xì)胞）和對(duì)照組（加入與實(shí)驗(yàn)組等量培養(yǎng)基），每組各設(shè) 6個(gè)復(fù)孔。置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。在預(yù)定時(shí)間前4 h以MTT法在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度（optical density，OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=（1-OD實(shí)驗(yàn)組/ OD對(duì)照組）×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCL-1細(xì)胞，分別加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀鈉培養(yǎng)24 h、48 h后離心收集細(xì)胞。用400 μL 1×結(jié)合緩沖液使細(xì)胞懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106/mL，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次，加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min。加入10 μLPI混勻后2～8 ℃ 避光孵育5 min，在1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，以左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限為非活細(xì)胞，即晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；右下象限表示早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)早期凋亡率。

1.2.5 實(shí)時(shí)qPCR法檢測(cè)磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinases，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA相對(duì)表達(dá)量：將細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SCL-1細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)并培養(yǎng)過(guò)夜，分別加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀鈉培養(yǎng)24 h，按照Trizol試劑說(shuō)明書的方法行總RNA提取，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后使用實(shí)時(shí)qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增基因包括PI3K、AKT、mTOR，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，根據(jù)Genebank公布的序列，采用Oligo6設(shè)計(jì)所需引物，引物序列見(jiàn)表1。以空白對(duì)照組的表達(dá)量定義為1，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氟伐他汀鈉對(duì)SCL-1細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，用10、20、50、100 μmol/L氟伐他汀鈉干預(yù)SCL-1細(xì)胞后，相同時(shí)間隨著氟伐他汀鈉濃度增加SCL-1細(xì)胞抑制率上升（P＜0.01）；同濃度氟伐他汀鈉對(duì)SCL-1細(xì)胞分別干預(yù)24、48、72 h后，細(xì)胞增殖的抑制率隨干預(yù)時(shí)間增加而上升（P＜0.01），見(jiàn)表2。氟伐他汀鈉在48 h對(duì)SCL-1的IC50為10.70 μmol/L。

2.2 氟伐他汀鈉對(duì)SCL-1細(xì)胞早期凋亡的影響

結(jié)果顯示，不同濃度處理SCL-1細(xì)胞早期凋亡率隨氟伐他汀鈉的濃度增加而上升，呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.01）；相同濃度下，48 h早期凋亡率高于24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3，圖1、2。

表2 不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細(xì)胞抑制率（%）Tab.2 Inhibition rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

2.3 不同濃度氟伐他汀鈉對(duì)PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，不同濃度的氟伐他汀鈉培養(yǎng)SCL-1細(xì)胞24 h后PI3K、AKT、mTORmRNA相對(duì)表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而降低（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表3 不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細(xì)胞早期凋亡率（%）Tab.3 Early apoptotic rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

圖1 各組24 h 時(shí)Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖Fig.1 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 24 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

圖2 各組48 h時(shí) Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖Fig.2 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 48 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

3 討論

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶具有高度專一性的競(jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)力抑制劑。自20世紀(jì)80年代問(wèn)世以來(lái)，普遍應(yīng)用于臨床高脂血癥的治療［9-10］。HMG-CoA參與甲羥戊酸代謝途徑，他汀類藥物作為該酶的抑制劑抑制了甲羥戊酸以及下游產(chǎn)物的生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖和分化，調(diào)控細(xì)胞周期［11-12］。他汀類藥物能發(fā)揮多效細(xì)胞作用，其潛在機(jī)制包括：（1）洛伐他汀在SCC9、SCC25細(xì)胞系中可以損害線粒體功能并降低細(xì)胞ADP/ATP比率，觸發(fā)了LKB1/AMPK通路活化，從而影響腫瘤蛋白的翻譯［13］；（2）Hippo通路是一條經(jīng)典的致癌通路，TAZ是該通路的下游效應(yīng)物，有研究［14］發(fā)現(xiàn)他汀類對(duì)TAZ高表達(dá)的肝癌細(xì)胞具有抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用；（3）辛伐他汀抑制了DNA與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制抗凋亡蛋白BCLXL表達(dá)，增加PTEN轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［15］。

表4 24 h時(shí)不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量（%）Tab.4 Relative mRNA expression levels of PI3K，AKT，and mTOR after 24 h treatment of SCL-1 cells with different concentrations of fluvastatin sodium

CSCC是一種常見(jiàn)的皮膚腫瘤，治療方式多樣，其中以手術(shù)切除為佳。然而由于手術(shù)治療易引起組織缺損且容易留下瘢痕，又因局部外用藥物及放射治療方法存在局限性，較易復(fù)發(fā)，臨床應(yīng)用受限［16］。因此探尋新的治療藥物來(lái)抑制CSCC的發(fā)生發(fā)展具有很高的臨床價(jià)值。他汀類藥物在多種腫瘤中表現(xiàn)了顯著的生物學(xué)效應(yīng)，本研究采用了臨床常用的氟伐他汀鈉處理SCL-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氟伐他汀鈉以濃度依賴性和時(shí)間依賴性的方式抑制SCL-1細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法結(jié)果顯示氟伐他汀鈉的濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，SCL-1細(xì)胞凋亡率越高，由此可推測(cè)氟伐他汀鈉可以抑制SCL-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

PI3K介導(dǎo)的Akt/mTOR通路是一條經(jīng)典的促存活和抗凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在上皮源性惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中具有重要作用［17］。本研究在明確氟伐他汀鈉能夠誘導(dǎo)SCL-1凋亡后，進(jìn)一步對(duì)可能發(fā)揮作用的分子機(jī)制進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，氟伐他汀鈉可以降低PI3K、AKT、mTORmRNA相對(duì)表達(dá)量，且隨著藥物濃度的增加抑制作用明顯增強(qiáng)。這表明氟伐他汀鈉可以抑制SCL-1細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR通路。

綜上所述，氟伐他汀鈉具有抑制人CSCC增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，推測(cè)其機(jī)制之一可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)，本研究為CSCC的藥物治療開拓了新的方向。