長壽蛋白6對胃癌預后的影響及作用機制

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧省腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

胃癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居第五位和第三位［1］。雖然近年來胃癌診斷與治療技術(shù)的發(fā)展在一定程度上延長了患者的總生存期，但由于大部分患者在初診時即被診斷為晚期，常因快速多臟器轉(zhuǎn)移而導致死亡，5年生存率僅為5%［2］。因此，尋找敏感、特異的生物標志物對準確判斷胃癌患者預后具有重要意義。

長壽蛋白6（sirtuin 6，SIRT6）是NAD+依賴性組蛋白去乙酰酶長壽蛋白家族成員之一［3-4］?，F(xiàn)已明確，除去乙?；富钚酝?，SIRT6還具有去長鏈脂肪?；富钚裕?，5-6］，在DNA修復、轉(zhuǎn)錄復制、端粒維持、細胞凋亡等生物過程中發(fā)揮重要作用。已有研究顯示，SIRT6的異常表達與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，SIRT6在腫瘤中發(fā)揮何種作用結(jié)論尚不一致。在甲狀腺癌［7-8］、皮膚鱗狀細胞癌［9］、乳腺癌［10］及前列腺癌［11］等腫瘤中，SIRT6表達明顯上調(diào)，且高表達患者預后不良，提示SIRT6發(fā)揮促癌作用；而在肺癌［12］、結(jié)腸癌［13］、肝癌［14-15］、骨肉瘤［16］等腫瘤組織中SIRT6表達則明顯低于癌旁組織，低表達患者分期較差且生存期較短，提示SIRT6發(fā)揮抑癌作用。這種表達和對預后作用的不一致性提示SIRT6在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同作用，SIRT6對腫瘤的影響還需進行深入探討。目前僅有的關(guān)于SIRT6對胃癌預后影響的研究中，ZHOU等［17］利用免疫組化方法分析了SIRT6在67例胃癌組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT6低表達患者的生存期明顯縮短，提示SIRT6是胃癌預后的保護因素。然而，該研究中臨床樣本量相對較小，且未探討SIRT6通過何種機制影響胃癌預后，因此SIRT6在胃癌中的作用和機制尚需深入研究。

為明確SIRT6在胃癌中的作用和機制，本研究利用人類腫瘤相關(guān)的基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）分析SIRT6對預后的影響及其與臨床病理學參數(shù)的相關(guān)性，并利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）結(jié)合細胞實驗，探討SIRT6影響胃癌發(fā)生發(fā)展的機制，旨在為明確SIRT6在胃癌中的預后意義和作用機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及樣本信息

從美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnollogy information，NCBI）的GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載基因表達譜胃癌樣本數(shù)據(jù)集GSE62254。收集GEO數(shù)據(jù)集中具有完整臨床病理學參數(shù)和生存資料的病例。

1.2 數(shù)據(jù)集篩選

基于SIRT6mRNA表達量，計算1年、3年和5年生存期時的受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線下的面積（area under curve，AUC）及約登指數(shù)（Youden index），選取AUC值最大的曲線計算出SIRT6表達的最佳截斷值。根據(jù)此最佳截斷值將數(shù)據(jù)進行二分類，低于該值的樣本為低表達組，高于該值的樣本為高表達組。

1.3 GSEA

采用GSEA3.0版本［18-19］進行分析。按1.2分組原則將樣本分為SIRT6高表達組和低表達組。利用 GSEA網(wǎng)站 MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲得 c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt數(shù)據(jù)集，按默認加權(quán)富集統(tǒng)計的方法進行富集分析，設(shè)置隨機組合次數(shù)為 1 000次。

1.4 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞株MGC803（3111C0001CCC000227 ）購于國家細胞資源平臺，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中于5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下培養(yǎng)。2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.5 siRNA順時轉(zhuǎn)染

將SIRT6siRNA 6 μL、Jet轉(zhuǎn)染試劑4 μL及緩沖液200 μL混勻并靜置10 min后加入6孔板的MGC803細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)Western blotting或Transwell檢測。SIRT6siRNA由唯尚立德公司合成，正義序列為5’-UCCAUCACGCUGGGUACAU-3’，反義序列為5’-AUGUACCCAGCGUGAUGGA-3’。

1.6 細胞遷移實驗

分別取2×104個MGC803/NC及MGC803/siSIRT6細胞種于Transwell小室的上室，下室加入含2.5%胎牛血清的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，取出小室，PBS沖洗2次，Giemsa染色40 min，顯微鏡下觀察并計數(shù)遷移至小室下層的細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用 R語言及SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。利用χ2檢驗分析SIRT6的表達與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗法進行生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT6表達與胃癌患者預后的相關(guān)性

比較1年、3年、5年總生存期下的SIRT6表達值的AUC，結(jié)果顯示總生存期1年時SIRT6表達值的AUC最大（AUC=0.615），從而計算出SIRT6的最佳截斷值為1.82（圖1A）。將GSE62254數(shù)據(jù)集中283例具有完整臨床資料的病例按SIRT6的最佳截斷值分為高表達組和低表達組。其中高表達組88例，低表達組195例。采用log-rank法進行生存分析結(jié)果顯示，SIRT6表達水平低的患者總生存期明顯低于表達水平高的患者（P＜0.001），提示SIRT6是胃癌的預后保護因子，其表達水平低的患者預后不良（圖1B）。

2.2 SIRT6表達與臨床病理學參數(shù)的相關(guān)性

圖1 SIRT6表達與胃癌患者預后的關(guān)系Fig.1 Effect of SIRT6 expression on the prognosis of gastric cancer

利用χ2檢驗分析SIRT6高表達組和低表達組與各臨床病理學參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果如表1所示，SIRT6高表達組中M1分期比例顯著低于低表達組（分別為3.5%、12.7%，P=0.031），提示SIRT6高表達可能抑制胃癌轉(zhuǎn)移。然而，SIRT6表達與性別、年齡、組織學分級、T分期、N分期并無明顯相關(guān)性。這一結(jié)果提示SIRT6低表達可能通過促進胃癌轉(zhuǎn)移引起預后不良。

表1 SIRT6表達與臨床病理學參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between SIRT6 expression and clinicopathological parameters

2.3 SIRT6對胃癌細胞遷移的影響

為探討SIRT6對胃癌細胞遷移的影響，在MGC803細胞中瞬時敲減SIRT6后，Transwell小室法檢測其遷移能力的變化。結(jié)果顯示，敲減SIRT6后，MGC803胃癌細胞中SIRT6的蛋白表達水平明顯降低（圖2A），遷移能力也明顯增強（P＜0.05）（圖2B、2C），提示SIRT6表達下調(diào)可促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移。

2.4 SIRT6功能基因集富集分析

為探討SIRT6可能通過哪些通路影響胃癌轉(zhuǎn)移，利用KEGG通路基因集作為參照基因集進行了GSEA分析。結(jié)果顯示，SIRT6低表達與Wnt信號通路及骨架蛋白調(diào)控等通路相關(guān)，提示SIRT6表達水平降低可能通過激活Wnt信號及骨架蛋白調(diào)控等通路促進了胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。見圖3。

2.5 SIRT6對Wnt通路及細胞骨架調(diào)控通路中integrin α5的影響

敲減SIRT6后檢測β-catenin失活型磷酸化水平及integrin α5及integrin V的表達水平。如圖4所示，敲減SIRT6后，β-catenin失活型磷酸化水平降低，integrin α5表達水平升高，而integrin V并無明顯變化，提示SIRT6可抑制Wnt通路活化及細胞骨架相關(guān)蛋白integrin α5的表達。提示SIRT6表達水平降低可通過激活Wnt通路，上調(diào)integrin α5促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移。

圖2 SIRT6對胃癌細胞遷移的影響Fig.2 Effect of SIRT6 on cell migration in gastric cancer cells

圖3 SIRT6功能基因集富集分析Fig.3 Gene set enrichment analysis of SIRT6

圖4 SIRT6對下游相關(guān)通路的影響Fig.4 The effect of SIRT6 on the downstream pathway

3 討論

本研究通過分析GSE62254胃癌數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)SIRT6低表達的胃癌患者轉(zhuǎn)移發(fā)生率高且預后不良，SIRT6是胃癌預后保護因素；通過在胃癌細胞中敲減SIRT6發(fā)現(xiàn)SIRT6表達水平降低可通過活化Wnt通路及上調(diào)intergrin α5蛋白表達促進胃癌細胞遷移。

現(xiàn)有研究顯示，SIRT6可抑制肺癌［12，20］、結(jié)直腸癌［13，21］、膀胱癌［20］等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肺癌中，SIRT6低表達患者的總生存期及無復發(fā)生存期（disease-free survival，DFS）均短于高表達患者，且低表達患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；另有研究［13，21］顯示，SIRT6在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，且其低表達患者的腫瘤浸潤能力更強，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率也明顯提高。同樣在膀胱尿路上皮癌研究［22］中也證實SIRT6的表達與T分期呈負相關(guān)。這些研究提示了在多種腫瘤中SIRT6可能作為預后保護因子，通過抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，其低表達往往導致腫瘤進展迅速、預后較差。本研究中分析GSE62254數(shù)據(jù)集中SIRT6mRNA表達水平與胃癌預后的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，SIRT6低表達患者總生存期明顯短于高表達患者，與既往胃癌的研究結(jié)果類似。本研究還發(fā)現(xiàn)SIRT6低表達患者的轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯升高，且在胃癌細胞中敲減SIRT6后，細胞的遷移能力明顯增強。然而本研究并未發(fā)現(xiàn)SIRT6表達與腫瘤大小具有相關(guān)性。這些結(jié)果提示SIRT6表達降低可能通過促進轉(zhuǎn)移而非促進腫瘤增殖導致胃癌預后不良。同時也提示SIRT6可作為潛在的胃癌預后預測的生物學標志物。當然，由于本研究是利用GEO數(shù)據(jù)庫中SIRT6mRNA水平進行的分析，無法完全代表SIRT6在胃癌中的蛋白表達情況，后續(xù)還應擴大樣本量、并結(jié)合免疫組化方法分析其對胃癌預后的影響，進一步明確SIRT6是否可作為胃癌預后預測的生物學標志物。

研究［13］發(fā)現(xiàn)，SIRT6在結(jié)腸癌細胞系中均呈低表達，且其表達減低通過激活AKT通路發(fā)揮促進結(jié)腸癌細胞增殖侵襲、抑制凋亡作用。SZYMURA等［23］研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6可以抑制GFPT2和N-鈣黏蛋白的表達，逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），進而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移。SIRT6表達較高的骨肉瘤患者總生存率也明顯優(yōu)于低表達者，且SIRT6的表達減低也能促進N-鈣黏蛋白的表達，增強骨肉瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移能力［16］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)敲減SIRT6雖然增強了胃癌細胞的遷移能力，但并未發(fā)現(xiàn)其發(fā)生EMT形態(tài)改變，也并未檢測到AKT通路的活化。因此本研究又利用GSEA富集分析方法，分析GSE62254胃癌數(shù)據(jù)集中與SIRT6低表達顯著相關(guān)的信號通路，探索SIRT6低表達促進胃癌轉(zhuǎn)移的新的可能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT6低表達與Wnt信號激活及骨架蛋白調(diào)控等通路密切相關(guān)。進一步通過敲減胃癌細胞中的SIRT6表達后證實，β-catenin活化水平及integrin α5表達水平升高。這充分證明SIRT6可抑制Wnt通路活化及integrin α5表達，從而抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果揭示了SIRT6抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的新機制。

綜上所述，本研究利用在線數(shù)據(jù)分析、GSEA分析及細胞實驗證明SIRT6低表達可能通過激活Wnt通路及上調(diào)integrin α5表達促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移，導致胃癌患者預后不良。本研究揭示了SIRT6在胃癌發(fā)展中的作用，為明確SIRT6是否能成為胃癌預后標志物及治療靶點提供了線索和科學依據(jù)。